Серологический метод диагностики туляремии.

· РА с сывороткой крови больного туляремией и туляремийным диагностикумом (демонстрация, диагностичес­кий титр 1:100).

· РНГА с сывороткой крови больного туляремией и эритроцитарным туляремийным диагностикумом (демонстрация, диагностический титр 1:1280).

· ИФА с сывороткой крови больного туляремией (демонстрация, диагностичес­кий титр 1:100).

3. Специфическая профилактика туляремии: живая вакцина (вы­сушенная живая культура вакцинного штамма туляремии).

Микробиологическая диагностика сибирской язвы

Основным источником инфекции являются больные травоядные животные, от которых человек заражается при непосредственном контакте, алиментарным, аэрогенным или трансмиссивным путями. Чаще всего возникает кожная форма инфекции с образованием характерного сибиреязвенного карбункула в виде уголька (anthrax), реже – кишечная, легочная, септическая формы. Методы микробиологической диагностики сибирской язвы отражены в схеме 6.

Схема 6. Микробиологическая диагностика сибирской язвы

	Материал: отделяемое карбункула или язвы, испражнения, моча, мокрота, кровь

 

Серологический метод Постановка РНГА, РА с целью определения антител в крови больного

 

	Аллергодиагностика Постановка внутрикожной аллергической пробы с тулярином. Учет через 24-48 часов.

	Выявление сибиреязвенного антигена Постановка реакции термопреципитации Асколи с преципитирующей противосибириязвенной сывороткой
		Генодиагностика. ПЦР

Микроскопический метод. Мазки из исследуемого материала окрашивают по Граму, Романовскому-Гимзе, Ребитеру (капсула), а также люминесцирующей сибиреязвенной сывороткой. Обнаружение в препаратах окруженных капсулой крупных грамположительных ба­цилл в виде цепочек дает возмож­ность поставить предварительный диагноз сибирской язвы (рис.11 а). В качестве экспресс-метода диагностики применяется РИФ, с помощью которой выявляют характерные сибиреязвенные бациллы в виде палочек со светящимся жел­то-зеленым ободком (рис. 11 б.).

Бактериологический метод -посев исследуемого материала на МПА, кровяной агар в чашках Петри или PLET-arap с полимиксином В, лизоцимом, этилен-диаминотетраацетатом (ЭДТА) и ацетатом таллия. Контаминированный мате­риал из внешней среды, от животных, из старых трупов предварительно прогревают при 63 °С в течение 15 мин с целью уничтожения вегетативных форм микроорга­низмов. Посевы помещают в термостат на сутки. Через 20 —24 ч инкубации посевов при 37⁰ С на МПА обнаруживают характерные шероховатые колонии в виде «головы меду­зы», края которых при малом увеличении микроскопа имеют вид вьющихся локонов или «львиной гривы» - рис. 12. В бульоне характерен при­донный рост, напоминающий комочек ваты, при этом среда остается про­зрачной. Из осадка делают мазок и препарат висячей капли. В мазке обнаруживают бескапсульные грамположительные стрептобациллы (рас­положение в виде длинных цепочек в виде «бамбуковой палки»). В отличие от других почвенных бацилл возбудитель сибирской язвы неподвижен. Для выде­ления чистой культуры типичные колонии пересевают на ско­шенный МПА.

Капсулообразование можно выявить путем биопробы или при посевах в бульон Хоттингера, на специальную среду, содержащую раствор Хенкса и 40 % стерильной сыворотки крупного рогатого скота, МПА с 0,7 % бикарбоната натрия, среду Буза (3%голодный агар с 15% дефибринированной крови барана), а также в дефибринированную лошадиную кровь. Посевы выращивают в течение 18-24 часов при температуре 37⁰ С в атмосфере 5-7% СО_2.

А б

 

Рис. 11. Возбудитель сибирской язвы(Bacillus anthracis). а - окраска по Граму, б – РИФ. х630

Рис. 12. Колония Bacillus anthracis. х56

 

Идентификацию выделен­ной культуры Bacillus anthracis (3-й день исследования) и ее дифференциацию от сходных непатогенных бацилл проводят путем посева уколом в желатину (разжижение в виде елочки, перевернутой вершиной вниз), изучения биохимических свойств, фаголизабельности и заражения животных. Определяют также чувствительность культуры к ан­тибиотикам.

Одним из характерных признаков возбудителя сибирской язвы является тест «жемчужного ожерелья».На поверхность МПА в чашке Петри с 0,5 и 0,05 ЕД/мл пенициллина засевают 3-ча­совую бульонную культуру выделенного микроорганизма, через 3 ч инкубирования при 37⁰ С готовят мазки, в которых при микроскопии находят «жемчужные ожерелья» в виде округлившихся стрептобацилл сибирской язвы. Почвенные ба­циллы сохраняют форму палочек, расположенных цепочками.

Биологические свойства возбудителя сибирской язвы и сходных с ним бацилл отражены в табл. 7.

Наличие сибиреязвенного антигенав разложившемся трупе жи­вотного, коже (свежей, сухой, выделанной) и изделиях из нее, шкурках, мехе, шерсти определяют с помощью реакциитермо­преципитациипо Асколи.Исследуемый материал измельчают, за­ливают 10 —20-кратным объемом физиологического раствора, кипятят в течение 10-45 мин., после чего фильтруют. Полученный экстракт осторожно наслаивают на преципитирующую сибиреязвенную сыворотку в узкой преципитационной пробирке. На границе экстракта и преципитирующей сыворотки в течение 1- 5 мин в случае положительной реакции появляется кольцо белого цвета (преципитат). Контроли включают постановку реакций с заведомо положительной и отрицательной сывороткой, нормальной сывороткой и т.д.

Биопроба. Исследуемымматериалом подкожно заражают двух белых мышей., которые погибают через 24-48 ч после заражения. В мазках из внутренних органов и крови обнаружива­ют типичные капсульные бациллы. Проводится бактериологическое исследование трупа белой мыши с целью выделения чистой культуры сибиреязвенных бацилл.

Таблица 7. Дифференциально-диагностические признаки сибиреязвенной и других бацилл

 

Признак	Вид микроорганизмов
	Bacillus anthracis	Bacillus cereus	Bacillus mycoides	Bacillus thuringiensis	Bacillus subtilis	Bacillus Megaterium
Капсула	+	-	-	-	-	-
Подвижность	-	+	-	+	+	+
Гемолиз	-	+	-	+	-	+
Рост в анаэробных условиях	+	+	+	+	-	-
Лецитиназа	+	+	+	+	-	-
Аргининдегидролаза	-	V	V	+	-	-
Нитpaтpeдyктaзa	+	+	+	+	+	-
Патогенность для мышей	+	-	-	-	-	-
Ферментация до кислоты:
глицерина	-	V	+	+	+	+
маннита	-	-	-	-	+	+
салицина	-	V	+	+	+	+

 

Обозначения: «-«- отрицательная; «+» - положительная; «V» - вариабельная реакции.

 

Серологический метод выполняетсяв тех случаях, когда не удается обнаружить возбудителя в материале. Для определения антител в сыворотке крови больного использу­ют реакции латекс-агглютинации и РНГА с протективным сибиреязвенным антигеном.

Аллергический метод – постановка внутрикожной аллергической пробы с аллергеном сибиреязвенной бациллы - антраксином. Результаты учитывают через 24 ч. Пробу считают положительной при наличии гиперемии и инфильтрата диаметром более 15 мм.

Самостоятельная работа студентов

1. Микроскопия демонстрационных микропрепаратов возбудителя сибирской язвы (Bacillus anthracis, окраска по Граму). Бациллы сибирской язвы - крупные спорообразующие, капсульные грамположительные палочки, располагающиеся цепочками, напоминая бамбуковую палку.

2. Бактериологический метод. Изучить характер роста на МПА и МПБ культуры B.cereus, имитирующей рост Bacillus anthracis. На жидкой питательной среде (бульон Хоттингера) рост бацилл напоминает комочек ваты, на плотной питательной среде (МПА, сывороточный МПА длявыявления капсулообразования) - «гриву льва», или «голову медузы». Сибиреязвенная палочка разжижает желатин в виде елоч­ки верхушкой вверх. Под действием пенициллина сибиреязвен­ные палочки образуют сферопласты в виде жемчужин, что используется для дифференциации Bacillus anthracis от непатогенных бацилл. Отразить в рабочей тетради биологические свойства Bacillus anthracis и сходных с ней бацилл, пользуясь таблицей7.

Для оценки загрязненности сырья (шерсть, шкуры животных) возбудителем сибирской язвы используется реакция кольцепреципатации по Асколи. Поставить реакцию по Асколи. Ингредиенты: преципитирующая сибиреязвенная сыворотка, термостабильный антиген из исследуемого материала, физио­логический раствор. Схема постановки реакции Асколи: в препиптационную пробирку наливают 0,5 мл преципитирующей сыворотки, пастеровской пипеткой сверху осторожно наслаивают антиген. В положительном случае на границе сыворотки и антигена появляется преципитат в виде кольца. В контрольную пробирку вместо антигена вносят физиологический раствор.

3. Серологическая диагностика сибирской язвы. Учесть реакцию непрямой гемагглютинации с сывороткой крови больного и эритроцитарным сибиреязвенным диагностикумом.

4. Аллергический метод диагностики сибирской язвы. Для постановки кожной аллергической пробы у больных сибирской язвой используется сибиреязвенный аллерген - антраксин (белково-полисахаридно-нуклеиновый комплекс, полученный при гидролизебацилл сибирской язвы).

5. Специфическая профилактика сибирской язвы: живая вакцина СТИ (высушенная взвесь живых спор вакцинного штамма - вариан­та сибиреязвенных бацилл, названа в честь Санитарно-технического института, в котором она была разработана).

6. Специфическое лечение сибирской язвы: противосибиреязвенныйиммуноглобулин (гамма-глобулиновая фракция сыворотки крови лошадей, гипериммунизированных живой вакциной и вирулент­ным штаммом В.anthracis).

После изучения темы студент должен знать: таксономию, морфологические и биологические свойства возбудителей основных бактериальных зоонозных инфекций (чумы, туляремии, сибирской язвы), а также патогенез, эпидемиологию, основные клинические проявления и иммунитет; основные методы диагностики, специфической профилактики и лечения этих инфекций.

Изучив тему, студент должен уметь: уметь ставить серологические реакции при туляремии, трактовать результаты микробиологических анализов при чуме,туляремии, сибирской язве.

Педиатрические аспекты темы

1. Дети в возрасте от 1 до 2 лет прививаются противочумной вакциной только при неблагоприятной эпидемической ситуации, при этом дети до 7 лет прививаются накожно, а с 7 лет - накожно и подкожно.

2. В неблагополучной по туляремии местности прививкам живой вакциной подвергают все население с 7-летнего возраста. По эпидемическим показаниям вакцинируют детей старше 2 лет.

Тема 4. ВОЗБУДИТЕЛИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЗООНОЗНЫХ ИНФЕКЦИЙ: БРУЦЕЛЛЕЗА, ЛЕПТОСПИРОЗА, БОРРЕЛИОЗОВ, ЛИСТЕРИОЗА

Цель занятия: изучение биологических свойств возбудителей бактериальных зоонозных инфекций - бруцеллеза, лептоспироза, клещевого боррелиоза, листериоза и методов их лабораторной диагностики, профилактики и лечения.