Микробиологическая диагностика анаэробной инфекции.

Раневую анаэробную инфекцию у человека вызывают как спорообразующие анаэробные бактерии (Clostridium perfringens, Clostridium novy, Clostridium oedematiens, Clostridium septicum, Clostridium sordelli, Clostridium histolyticum), так и неспорообразующие анаэробные микроорганизмы родов Bacteroides, Peptococcus, Peptostreptococcus, Veilonella и др.

Методы микробиологических исследований при анаэробной инфекции представлены в схеме 3.

Бактериоскопический метод. Проводится микроскопия окрашенных по Граму, Цилю-Нильсену и Гинсу-Бурри мазков, приготовленных из раневого отделяемого, отечной жидкости, некротизированной ткани. Обнаружение в препаратах крупных прямых грамположительных палочек, образующих капсулы и центрально или субтерминально расположенные споры (рис. 3), дает основание поставить предварительный диагноз газовой гангрены. Для экспресс-диагностики применяют прямой метод иммунофлюоресценции.

 

Схема 3. Микробиологическая диагностика анаэробных инфекций
Материал: кусочки некротизированных тканей, экссудат, гной, отделяемое ран, кровь, секционный материал.
Микроскопический метод. Микроскопия окрашенных по Граму, Цилю-Нильсену и Гинсу-Бурри мазков, приготовленных из материала от больного с целью обнаружения крупных грамположительных палочек, образующих капсулы и центрально или субтерминально расположенные споры Биопроба Заражение морских свинок материалом от больного в смеси с антитоксическими сыворотками против различных видов клостридий (РН) или без них. Гибель контрольной морской свинки через 30 минут – 4 часа. В РН выживает одна морская свинка, у которой токсин нейтрализуется соответствующим видом сыворотки. Бактериологический метод. 1. день. Посев исследуемого материалана среды Цейсслера (анаэробный кровяной	МПА), Китт-Тароцци, железо-сульфитный агар (ЖСА) и молоко (образование через 3-4 часа губкообразного сгустка, погруженного в прозрачную жидкость). 2 день –учет роста(помутнение и образование газа на среде Китт-Тароцци; черные в виде чечевичек, дисков, комочков ваты колонии в глубине ЖCA; шероховатые, крупные, плоские сероватые колонии с зоной гемолиза на среде Цейсслера). Пересев на среду Китт-Тароцци для выделения чистой культуры. 3 день – Проверка чистоты выделенной культуры, пересев на среды «пестрого» ряда с целью определения биохимических свойств, выявление токсинов (биопроба) и факторов патогенности с целью идентификации выделенной культуры анаэробов. 4 день.Заключение о виде выделенной культуры анаэробов.

Бактериологический метод. Производят посев исследуемого материалана среды Цейсслера (анаэробный кровяной МПА), Китт-Тароцци, железо-сульфитный агар (ЖСА) и молоко. В молоке через 3-4 часа образуется губкообразный сгусток, погруженный в прозрачную жидкость. На среде Китт-Тароцци через сутки регистрируется помутнение и образование газа, на ЖCA - черные колонии в глубине агарового столбика, на среде Цейсслера – шероховатые (реже – гладкие), крупные, плоские сероватые колонии с зоной гемолиза. В глубине плотных питательных сред образуются колонии в виде чечевичек, дисков, комочков ваты и т.д. В мазках из колоний обнаруживают крупные грамположительные палочки (рис. 5). Для выделения чистой культуры возбудителей газовой гангрены типичные колонии пересевают на среду Китт-Тароцци и идентифицируют до вида в соответствии с таблицами 4 и 5.

 

Рис. 4. Возбудитель газовой гангрены (Clostridium perfringens) в материале от больного. Окраскапо Граму. х 900	Рис. 5. Возбудитель газовой гангрены. Чистая суточная культура Clostridium perfringens. Окраскапо Граму. х 900

 

 

Таблица 4. Биологические свойства неспорообразующих и спорообразующих анаэробов

Свойства	Бактерии
Peptococcus	Peptostreptococcus	Veilonella	Bacteroides	C.perfringens	C.novy	C.septicum	C.sordelli	C.histolyticum
Морфология	кокки	кокки	кокки	палочки	палочки	палочки	палочки	палочки	палочки
Подвижность	-	-	-	±	-	+	+	+	+
Споры	-	-	-	-	+	+	+	+	+
Окраска по Граму	+	+	-	-	+	+	+	+	+
Ферментация углеводов	+	+	-	+	+	+	+	+	-
Свертывание молока	-	-	+	+	+	v	-	+	+
Продукция H2S	+	-	+	±	-	-	-	v	v
Продукция индола	-	-	-	±	-	-	-	-	-
Разжижение желатины	-	-	-	±	+	+	+	+	+
Редукция нитратов	±	-	+	±	±	±	±	-	-
Гемолиз эритроцитов		-	-	±	+	+	+	+	+
Образование токсина	-	-	-	-	+	+	+	+	+

Обозначения: (+) - постоянный признак, (±) - непостоянный признак, (-) – отсутствие признака, V- вариабельный признак

Таблица 5. Биологические свойства основных возбудителей газовой гангрены и столбняка

Виды клостридий	Капсула	Подвижность	Лецитиназа	Индол	Ферментация
лактозы	сахарозы	маннита
Clostridium perfringens	+	-	+	-	+	+	+
Clostridium Novy	-	+	+	-	-	-	-
Clostridium septicum	-	+	_	-	+	-	-
Clostridium Tetani	-	+	_	+	-	-	-

 

Обозначения: (+) - постоянный признак, (-) – отсутствие признака,

Определение лецитиназной активности. Положительная реак­ция на лецитиназу проявляется в виде помутнения взвеси лецитина. При отрицательной реакции, которая наблюдается при нейтрализации фермента соответствующей антисывороткой, жидкость остается прозрачной.

Окончательную идентификацию выделенных клостридий газовой гангрены проводят с помощью биопробы (см. ниже) путем постановки реакции нейтрализации с поливалентными и моновалентными сыворотками для выявления и типирования экзотоксинов клостридий.

Биопроба. Смесь исследуемого материала с моновалентными антитоксическими сыворотками против различных видов клостридий вводят подкожно морским свинкам. Контролем служит морская свинка, которой вводят исследуемый материал без сывороток. При наличии токсина контрольная морская свинка погибает через 30 минут – 4 часа после инъекции материала. В опытах нейтрализации токсина антитоксическими сыворотками выживает одна морская свинка, при этом вид сыворотки соответствует виду токсина.

Самостоятельная работа студентов.

1. Изучить питательные среды и аппараты, применяемые для культивирования патогенных анаэробов (демонстрация).

2. Морфологические свойст­ва Clostridium perfringens в чистой культуре (окраска по Граму, демонстрация – рис. 5). Зарисовать. Палочки крупные, грамположительные, образуют споры и капсулы.

3. Культуральные cвойства Clostridium perfringens на среде Китт- Тароцци, железо-сульфитном агаре (ЖСА) и молоке (демонстрация). В молоке через 3-4 часа образуется губкообразный сгусток, отде­лившаяся жидкость прозрачна. На среде Китт-Тароцци - помутнение, на ЖСА - черные колонии в глубине агарового столбика (рис. 3).

4. Ферментативная активность возбудителей анаэробной инфекции на средах Гисса. Обратить внимание на высокую фер­ментативную активность С.perfringens.

5. Лецитиназная активность Clostridium perfringens. Положительная реак­ция на лецитиназу проявляется в виде помутнения взвеси лецитина. При отрицательной реакции, которая наблюдается при нейтрализации фермента соответствующей антисывороткой, жидкость остается прозрачной. Демонстрацию описать, зарисовать.

6. Знакомство с препаратами для специфической профилактика и терапии газовой гангрены (антитоксические сыворотки моновалентные – против Clostridium perfringens, Clostridium novy, Clostridium oedematiens, Clostridium septicum и т.д., а также поливалентная, полученные при гипериммунизации лошадей).