Бактериологическое исследование анаэробной микрофлоры

(Коршунов В.М. с соавт., 1999)

Бактериологическое исследование вагинальной микрофлоры включает следующие этапы:

I. Взятие, транспортировку и подготовку к посеву исследуемого материала.

П. Посев исследуемого материала на селективные питательные среды с последующим определением количественного и качественного состава микрофлоры;

III. Регистрацию полученных результатов с заключением и рекомендациями врача-бактериолога.

Важным фактором, значительно влияющим на успех микробиологической диагностики, является корректный способ забора и транспортировки исследуемого материала, получаемого от больных. Основные правила, которые должны всегда соблюдаться при заборе материала, следующие:

1) Материал для исследования должен быть взят в день обращения больного в лечебное учреждение;

2) Взятие материала должен всегда осуществляться до начала антибактериальной терапии или до начала лечения биотерапевтическими препаратами, а также до начала проведения других местных терапевтических вмешательств;

3) Бактериологическая обработка исследуемого материала должна быть осуществлена по возможности быстро - для предотвращения гибели бактерий, чувствительных к различным факторам окружающей среды, и во избежание размножения в исследуемом материале бактерий-комменсалов.

Рекомендуется использовать пробирки с 5 мл восстановленной (прокипяченной) тиогликолевой среды, заполненные газом (пропан) и закрытые хорошо притертыми резиновыми пробками. Пробирка со средой должна быть взвешена до внесения в нее исследуемого материала. От момента взятия материала до начала посева не должно проходить более 2-х часов.

 

Грамотрицательные неспорообразующие облигатно-анаэробные бактерии

Большинство грамотрицательных анаэробных бактерий могут быть изолированы на средах с добавлением канамицина и ванкомицина, гемина, витамина Кз или К₁ а также бараньих эритроцитов (5%). К базовым относят среды Columbia agar, Schaedler agar. Исследуемый материал засевают из 10^-6, 10^-7 и 10^-8 разведений. Срок инкубирования должен составлять 48 часов при температуре 35°С.

Эти среды позволяют культивировать бактерии, относящиеся к родам Bacteroides, Prevotella и Porphypomonas.

Бактерии рода Fusobacterium могут расти на вышеперечисленных средах. Однако, более предпочтительны среды Columbia agar, Schaedler agar с добавлением крови и содержащие 3,2 мг/л кристаллического фиолетового и 5 мг/л эритромицина.

Сразу после посева чашки со средами должны быть помещены в микроанаэростат. Кроме того, туда же помещают палладиевый катализатор для поглощения кислорода и индикатор для выявления свободного кислорода.. Катализатор перед употреблением регенерируют в сухожаровом шкафу при температуре 175-180° С в течение 1 часа. Затем микроанаэростат закрывают, удаляют из него воздух при помощи вакуумного насоса, после чего микроанаэростат заполняют нулевым поверочным азотом.

Вновь удаляют газ из микроанаэростата, заполняют его газовой смесью (5% СО₂, 10% Н₂, 85% N₂) и помещают в термостат. После 48 часов инкубации проводят первый учет чашек с отсевом типичных колоний на жидкие питательные среды для анаэробов для изучения культуральных свойств микроорганизмов и последующей идентификации, а также отсев на плотные питательные среды, которые затем культивируют в аэробных условиях, чтобы убедиться, что выросшие микроорганизмы не являются факультативно-анаэробными. После первого учета чашки возвращают в анаэростат и инкубируют еще в течение 72 часов. Затем повторно изучают морфологию колоний, обращая внмание на появление черного пигмента, и производят отсев в жидкие питательне среды материал из тех колоний, которые отсутствовали при первом учете чашек.

Идентификация грамотрицательных бактерий в зависимости от целей может быть ориентировочной (определение рода) или финальной (определение вида). Ориентировочная идентификация проводится по следующим характеристикам: рост в присутствии желчи (диски 5 мг), бриллиантового зеленого (диски 100 мкг), канамицина (диски 1000 мкг), ферментация глюкозы, наличие черного пигмента.

 

Материалы для анаэробного культивирования
LE001 Система для анаэробного культивирования HiAnaerobicTM System-10

Рис. 3. Материалы для анаэробного культивирования

 

В комплект входят прозрачная небьющаяся поликарбонатная емкость, алюминиевая крышка уплотнительное кольцо, штатив для чашек Петри, штатив для пробирок, газогенераторный пакет, катализатор, индикатор.

Анаэробная емкость - прозрачная небъющаяся пластиковая емкость объемом 3,5 литра. К ёмкости анаэростата металлическим хомутом. крепится прочная алюминиевая крышка Герметичность системы обеспечивается резиновым кольцом (прокладкой), располагающимся между алюминиевой крышкой и пластиковой емкостью.В крышку встроены: клапан для подачи газовой смеси; клапан сброса избыточного давления (срабатывает при давлении, превышающем 1 кг) или аварийный клапан; манометр для измерения давления, как отрицательного, так и положительного, в поликарбонатной емкости. С нижней стороны крышки крепится низкотемпературный катализатор

Для культивирования анаэробных микроорганизмов в системе HiAnaerobic System-10 используют штатив для чашек Петри (для культивирования бактерий в чашках Петри) или штатив для пробирок (для пробирочных жидких культур). Оба штатива изготовлены из нержавеющей стали. Штативы имеют специальные зажимы для крепления газогенераторного пакета (HiGas Pack, LE001A) и индикатора анаэробных условий (HiIndicator, LE001B).

Анаэробные условия в системе создает газогенераторный пакет (HiGas Pack). В набор газогенераторного пакета входят боргидрид натрия, винная кислота и бикарбонат натрия. Газогенераторный пакет достаточен для выработки 1800 мл водорода и 350 мл углекислого газа.

5. Система HiAnaerobic System-10 предназначена только для культивирования микроорганизмов.

Катализатор. Анаэробный катализатор представляет собой безопасную и эффективную модификацию устройства семейства "холодовых" катализаторов, повсеместно используемых для создания атмосферы с низким содержанием кислорода в анаэростатах. Катализатор может быть использован как в сочетании с газогенераторным пакетом, например, HiGas Pack (LE001A), так и в сочетании с методикой вакуумирования/замещения.

Каждый катализатор содержит 4 грамма шариков, покрытых палладием. Он пригоден для создания анаэробных условий в анаэростатах объемом до 3,5 литров.

 

 

Микроорганизмы рода Bacteroides

Группа Bacteroides fragilis (B. fragilis, B. vulgatus, B. thetaiotaomicron, B. distasonis, B. uniformis, B. caccae, B. ovatus, B. merdae, B. stercoris, B. ureolyticus, B. gracilis). Типовой вид - B. fragilis.

Морфология - палочковидные бактерии, полиморфны, неравномерно окрашиваются по Граму, спор не образуют, имеют капсулу, неподвижны.

Биохимические свойства. Бактерии этой группы сбраживают глюкозу и способны расти в присутствии желчи и канамицина, но ингибруются бриллиантовым зеленым, каталазаположительны. B. fragilis не образует индол, образует сероводород, гидролизует эскулин, ферментирует глюкозу, лактозу, сахарозу до кислоты, не расщепляет рамнозу. Микроорганизмы этого вида проявляют умеренную протеолитическую активность, не образуют лецитиназу, не гидролизуют гиппурат

Культуральные свойства. Хемоорганоторфы, Культивирование осуществляют на cпециальных базовых питательных средах Columbia agar, Schaedler agar, с добавлением бараньих эритроцитов, канамицина, ванкомицина в анаэробных условиях при 10% содержании СO₂ в атмосфере. Микроорганизмы рода Bacteroides группы fragilis образуют блестящие слизистые круглые колонии диаметром 3 -5 мм бежевого, иногда коричневого цвета.

Факторы патогенности - адгезивная активность, капсула, эндотоксин, ферменты патогенности (нейраминидаза, гиалуронидаза, фибринолизин, супероксид дисмутаза).

 

Микроорганизмы рода Porphypomonas

Род образуют некоторые микроорганизмы, входившие ранее в род Bacteroides.

Систематизировано 3 вида – P. asacharolytica (типовой вид), P.endodontalis, P.gingivalis, обитающие в ротовой полости (периодонте). Вызывают гингивиты, периодонтиты, поражения мягких тканей головы и шеи.

Морфология – короткие палочки размером 1,5-0,8 мкм, грамотрицательны, неподвижны, спор не образуют.

Биохимические свойства - асахаролитические бактерии, образуют индол.

Культуральные свойства Микроорганизмы рода Porphypomonas чувствительны к желчи и бриллиантовому зеленому, но резистентны к канамицину, образуют черный пигмент на плотных питательных средах, на кровяном агаре через 6-14 суток культивирования образуют коричнево-чёрные пигментированные колонии, для роста нуждаются в гемине и витамине К, стимуляторами их роста являются пептон, дрожжевой экстракт. Молодые колонии (24-48 часов культивирования) обладают способностью флюоресцировать красным, коралловым цветом при проходящем ультрафиолетовом облучении (365 нм). Бактерии этой группы, в отличие от других грамотрицательных анаэробов, являются чувствительными к ванкомицину (диски 5 мкг).

Факторы патогенности – эндотоксин, P.gingivalis агглютинирует эритроциты барана, секретирует коллагеназу, повреждая дентин, разрушант фибриноген.

Микроорганизмы рода Fusobacterium

Анаэробные грамотрицательные бактерии семейства Bacteroidaceae. 7 видов. Типовой вид - F.nucleatum.

Роль в патологии человека – Выделяют из различных полостей организма человека – ротовая, урогенитальный тракт, кишечник.

Морфология – грамотрицательные палочковидные, полиморфные, часто веретеноообразные, нитевидные клетки с заострёнными концами, спор не образуют.

Биохимические свойства – образуют масляную кислоту в качестве основного продукта метаболизма. Хемоорганотрофы, облигатные анаэробы, каталазоотрицательны. Образуют индол, образование сероводорода и гидролиз гиппурата - являются вариабельным признаком. При ферментации глюкозы может образовывать кислоту.

 

Таблица.5.