Микроскопический подсчет, подсчет выживаемости микробов при культивировании

 

Прямой микроскопический подсчёт суспензированных микробов можно осуществлять в камере Горяева. Можно также изучать материал в темном поле или при фазово-контрастном микроскопировании.

Подсчет жизнеспособных клеток из взятого образца проводят методом серийных разведений в стерильном физиологическом растворе (1:10, 1:20 и так далее). Из каждого разведения определенный объем засевают на поверхность плотной среды. После инкубации подсчитывают количество КОЕ (колониеобразующих единиц) и пересчитывают количество их на исходный объем.

Успех метода зависит от использования необходимых питательных сред и условий культивирования, так как большая часть резидентов является строгими анаэробами и микроаэрофилами.

Низкую высеваемость микробов можно объяснить недостаточной дисперсией, прилипанием микробов к поверхности стекла при приготовлении разведения и неудачным подбором питательной среды.

 

Исследование ротовой жидкости

Ротовую жидкость обычно берут у больных утром (9-11 часов) через 2 часа после приема пищи, собирая ее в течение 10 минут в стерильные пробирки. Эту слюну называют нестимулированной.

Стимулированную слюну получают после нанесения на спинку языка 1-2 капель стерильного 2% раствора лимонной кислоты или жевания 5 г парафина в течение 30 секунд. Паротидную слюну получают путем введения в проток специальной стерильной канюли.

Исследование кариозной полости

Сначала из кариозной полости стерильным бором убирают поверхностные слои размягченного дентина, смоченного слюной. Не допуская попадания в исследуемый материал слюны, другим стерильным бором обрабатывают полость и помещают дентин с помощью стерильной гладилки в транспортную среду.

Исследование корневых каналов

Материал из корневых каналов берут корневыми иглами, на которых находятся стерильные ватные турунды. Предварительно на 4-5 корневых игл накручивают тонкие ватные турунды, упаковывают их в бумажные пакетики и стерилизуют в автоклаве.

Исследование десневой жидкости

Из десневого желобка, патологического десневого кармана материал можно брать маленькой стерильной кюретажной ложечкой, скейлером. Десневую жидкость можно собирать по принципу капилярности стерильной микропипеткой, стерильными фильтровальными полосками, стерильными нитками.

 

 

Исследование соскобов со слизистой оболочки

Соскоб со слизистой оболочки спинки языка можно делать стерильным шпателем, гладилкой. Перед взятием материала из эрозий, язв необходимо удалить поверхностный налет сухим или смоченным изотоническим раствором тампоном, не применяя антисептических препаратов. Этот материал может быть использован для микроскопического и бактериологического методов исследования.

В некоторых случаях можно делать мазки-отпечатки со слизистой оболочки или из элементов поражения. Для этого сухое обезжиренное стекло с зашлифованными краями прикладывают несколько раз к исследуемому участку. Если имеются труднодоступные места, то можно для забора материала использовать стерильные резиновые столбики, приготовленные из ластиковой резинки, которые прикладывают сначала к пораженному участку, а затем к стеклу.

 

Бактериологический метод исследования материала при патологии полости рта и челюстно-лицевой области

Ведущую роль в развитии воспалительных заболеваний полости рта и челюстно-лицевой области играют облигатно-анаэробные и микроаэрофильные бактерии, что определяет необходимость обязательного использования техники анаэробного культивирования при диагностике данной патологии. Особое значение это имеет при гнойно-воспалительных процессах (флегмонах, абсцессах, фасциитах, остеомиелитах челюстно-лицевой области), когда адекватная антибактериальная терапия с учетом чувствительности выделенных из воспалительного очага бактерий является залогом успешного лечения больного в послеоперационном периоде.

Бактериологический метод исследования материала при данной патологии включает обычно параллельное поэтапное исследование в аэробных (традиционным методом) и анаэробных условиях. Для создания анаэробных условий в настоящее время обычно используют анаэростаты и газбоксы. Они представляют собой герметичные камеры, из которых с помощью вакуум-насоса откачивают атмосферный воздух, а затем заполняют бескислородными газовыми смесями. Оптимальной для развития облигатных анаэробов является смесь, состоящая из 80% азота, 10% углекислого газа, 10% водорода. Для нейтрализации остаточного кислорода в анаэростаты помещают палладиевые катализаторы, пирогаллол или другие химически редуцирующие кислород соединения.

Патологический материал при абсцессах, флегмонах и фасциитах берут пункцией с помощью толстой иглы и доставляют в лабораторию в шприце (воткнув иглу в стерильную резиновую пробку) или поместив в транспортную среду (Стюарта или тиогликолевую). В процессе оперативного вмешательства материал забирают с помощью стандартного ватного тампона, который помещают в транспортную среду. Транспортные среды, благодаря особенностям своего состава, обеспечивают резкое снижение метаболизма микробов и возможность длительного сохранения их жизнеспособности (от 6 до 12 часов).

I этап бактериологического исследования - получение изолированных колоний.

Обычно выполняется на чашках Петри с 5 % кровяным агаром - питательной средой, которая помимо нативной крови содержит такие факторы роста анаэробных бактерий как гемин (витамин К) и менадион. Среда является универсальной для роста большинства видов анаэробных и аэробных бактерий.

При возможности оценки количества материала (масса в г или объем в мл) проводят количественное исследование с последующим расчетом числа выросших колоний на единицу количества материала - КОЕ или CFU (колониеобразующая единица). Существует два основных варианта количественного исследования.

1. Метод разведения в жидкой питательной среде, например, в тиогликолевой или в сахарном бульоне. Готовят разведения исходного объема материала в 10, 100, 1000 и т.д. раз, а затем делают посев на отдельные чашки Петри в количестве 0,1 мл и равномерно распределяют материал по поверхности анаэробного гемагара.

2. Метод распределения (по Гольду и его модификации). Из определенного объема транспортной среды, после предварительного перемешивания (с целью равномерного распределения микробов во всем объеме), делают посев в первый сектор чашки Петри и тщательно растирают материал петлей. После чего петлю прожигают и из первого "грязного" сектора выполняют три линейных штриха во второй сектор. Затем также в третий и четвертый. Установлено, что при переходе к каждому последующему сектору концентрация бактерий падает на два порядка (поэтому при расчете используют множитель 10² для первого сектора, 10⁴ - для второго и т.д.).

Например, при получении 15 колоний в третьем секторе концентрация жизнеспособных бактерий в исследуемом объеме материала составит 15х10⁶ КОЕ.

Независимо от методики, чашки Петри с анаэробным гемагаром культивируют в анаэростате или газбоксе при температуре 37°С до 7-10 дней, хотя большая часть анаэробов дает хороший рост колоний уже на 3-4 день. При макроскопическом и микроскопическом изучении выросших колоний проводят сопоставление морфологии самих бактерий и колоний, которые они формируют, при выращивании в анаэростате и полученных на 5% кровяном агаре в аэробных условиях.

Принципиальное значение для дальнейшей идентификации имеет проведение теста на наличие каталазы: материал колонии смешивают на предметном стекле с каплей 0,5% перекиси водорода - активное образование пузырьков газа свидетельствует о наличии у данного микроба фермента каталазы, что обычно характерно для факультативно-анаэробных бактерий. Основные виды облигатно-анаэробных бактерий каталазу не продуцируют.