Лабораторная диагностика туберкулеза и микобактериозов

Легочные и внелегочные формы туберкулеза вызываются бактериями комплекса МТС (Mycobacterium tuberculosis complex ), а также нетуберкулезными микобактериями комплекса MAC ( M.avium complex, M.kansassii ). Микобактерии комплекса МАС чаще поражают лиц с иммунодефицитами различной этиологии (прежде всего, больных СПИДом). Методы микробиологической диагностики туберкулеза представлены в схеме 15.

Схема 15. Микробиологическая диагностика туберкулеза

 

 

 

 

 

Биопробана морских свинках или кроликах.

Генодиагностика. ПЦР для обнаружения специфических фрагментов ДНК микобактерий комплекса МТС (М.tuberculosis, M.bovis/BCG, M.africanum) в материале от больного и диф­ференцировки туберкулезных микобактерий от нетуберкулезных (комплекс МАС - M. avium, M. kansassii).

 

 

Материалом для исследования является мокрота, промывные воды бронхов, желудка бронхоальвеолярная жидкость, плевральный эксудат, кровь, моча, испражнения, синовиальная жидкость, биоптаты различных тканей.

Первичная обработка материала заключается в его обработке с целью деконтаминации при наличии посторонней микрофлоры, а также разжижения, гомогенизации и флотации при исследовании мокроты, бронхоальвеолярной жидкости и т.д. Для этого материал обрабатывают муколитическими (N-ацетил-β-цистеин) и антибактериальными (1-2% NaOH) веществами, центрифугируют 20 мин при 3000 g и супернатант удаляют. Осадок ресуспендируют в небольшом количестве ИР.

Микроскопический метод заключается в микроскопическом исследовании мазков из исследуемого материала, окрашенных специ­альными методами с целью выявления кислото-

устойчивых бактерий, что позволяет дать ориентировочное заключение. Отрицательный результат микроскопического исследования не является основанием для снятия диагноза «туберкулез». В настоящее время основным методом выявления микобактерий является люминес-

центная микроскопия препаратов, окрашенных аурамином в концентрации 1:1000 в течение 15 минут с последующим обесцвечиванием 3% солянокислым спиртом в течение 30 сек, промывкой и докрашиванием мазка в течение 1 минуты водным раствором родамина 6ж в концентрации 1:5000. Микобактерии обладают ярким желтым свечением на темном фоне. Метод Циля-Нильсена применяется реже (рис. 20). Обычно по Цилю-Нильсену окрашивают мазки из чистых культур. Ограничением бактериоскопического метода является то, что он не позволяет дифференцировать микобактерии между собой и от других кислотоустойчивых микроор­ганизмов.

 

Рис. 20. Туберкулезная палочка (Mycobacterium tuberculosis) в мокроте больного. Окраска по Цилю-Нильсену. Рубиново-красные палочки (одиночные или скоплениями) на голубом фоне. х 900

Бактериологический метод является основным мето­дом диагностики туберкулеза, обладая высокой чувствительностью и специфичностью.

Для культивирования мико­бактерий наиболее часто применяют среду Левенштейна- Йенсена, содержащую суспензию све­жих яиц, крахмал, глицерин, аспарагин, КН₃РО₄, суль­фат и цитрат магния, а также краситель малахитовый зеленый. Среду свертывают в наклонном положении при 85⁰ С в течение 45 мин. Применяются также другие яичные среды (Финна, мордовского) и синтетические жидкие питательные среды.Посевы инкубируют в термостате при температуре 37⁰ С в атмосфере с повышенным содержанием СО₂ (5-10 %) в течение не менее 8 недель, просматривая посевы каждые 3 дня. Культуры М.tuberculosis растут в шероховатой R-форме в виде крошкообразных или морщинистых колоний кремового цвета (рис. 21). Отсутствие роста микобактерий спустя 8 недель после посева свидетельствует об отрицательном результате бактериологического метода диагностики туберкулеза.

Для культивирования микобактерий применяется также метод микрокультур Прайса. Для этого на нескольких узких пред­метных стеклах делают толстые мазки, высушивают, обрабаты­вают несколько минут 2-6 % серной кислотой, после чего нейтрализуют. Затем стекла опускают в пробирки с гемолизированной цитратной кровью в разведении 1:4-1:8 и ставят в термостат. Через 7-14 стекла дней извлекают, препараты фиксируют, ок­рашивают по методу Циля-Нильсена и микроскопируют. Вирулентные штаммы микобактерий характе­ризуются ростом в виде жгутов или кос за счет образования корд-фактора.

 

Рис. 21. Колонии туберкулезной палочки на среде Левенштейна-Иенсена

Идентификация выделенной культуры микобактерий до вида осуществляется по общепринятой схеме на основании изучения типичной морфологии, характерных культуральных свойств (по температурному оптимуму, скорости роста, пигментоообразованию в темноте и на свету), биохимической активности (наличие нитратредуктазы, каталазы, уреазы, пиразинамидазы, продукции никотиновой кислоты - ниациновая проба, восстановления нит­ратов и теллурита калия, гидролиза твина-80), а также с применением молекулярно-генетических (ДНК-гибридизация) и химических методов, что позволяет сократить время на лабораторную диагностику туберкулеза до 4-7 дней.

Для определения ниацина к культуре микобактерий в жидкой пи­тательной среде добавляют 1 мл раствора KCN и 1 мл 5 % раствора хлорамина; положительная реакция характеризуется появлением ярко-желтой окраски. После учета результатов реакции KCN нейтрализуют добавлением в пробирки 3-5 мл 10 % раствора гидрокарбоната натрия.

Проводится также определение чувствительности микобактерий к антимикробным препаратам методом абсолютных концентраций (наиболее часто на жидких питательных средах или методом микрокультур по Прайсу, занимая время от 3 недель до 3 месяцев или на плотной среде Левенштейна-Йенсена) с оценкой результатов по задержке роста или по нитратредуктазной активности, что имеет важное значение для назначения адекватной терапии. Границы устойчивости туберкулезной палочки составляют для стрептомицина 5 мкг/мл, ПАСК – 10 мкг/мл, тубазида – 1 мкг/мл, циклосерина и этионамида – 30 мкг/мл. Разработана также ПЦР для определения чувствительности микобактерий к химиопрепаратам и антибиотикам. К другим методам определения лекарственной устойчивости М.tuberculosis относятся биологический (LRP –Luciferase-Reporter Phage – свечение резистентных микобактерий в присутствии генетически измененных бактериофагов, несущих ген люциферазы) и молекулярно-генетический, основанный на ПЦР.

Биопроба ранееиспользоваласьдля выделения микобактерий путем подкожного заражения морской свинки (чувствительны к М.tuberculosis ) и кролика (чувствительны к M.bovis) материалом от больного с последующим наблюдением за животными (до 4 месяцев). По истечении этого срока или при гибели животных проводилось микроскопическое и бактериологическое исследование органов с целью обнаружения туберкулезных микобактерий. В настоящее время биопроба в реальной практике применя­ется редко в связи с утратой антибиотикорезистентных штаммов микобактерий вызывать типичную инфекцию и гибель животных.

Генодиагностика. Разработана ПЦР, позволяющая обнаружить видоспецифические нуклеиновые кислоты микобактерий комплекса МТС (М.tuberculosis, M.bovis/BCG, M.africanum) непосредственно в клиническом материале от больного и диф­ференцировать туберкулезные микобактерии от нетуберкулезных – комплекс МАС (M. avium, M. kansassii). Метод ПЦР сопоставим с бактериологическим исследованием, однако выполняется быстро - в течение 24 часов.

При положительных результатах исследования методами бактериоскопии и ПЦР диагноз туберкулеза подтверждается и рекомендуется немедленное назначение противотуберкулезных препаратов по общепринятой схеме. Отрицательный результат ПЦР при обнаружении кислотоустойчивых микобактерии в мазках исключает наличие туберкулезных микобактерий комплекса МТС, поэтому в данной ситуации на­значаются антимикробные препараты, активные в отношении нетуберкулезных микобактерии комплекса МАС. В других случаях необходимо ждать результатов бактериологического исследова­ния.

Серодиагностика. Разработаны РСК, РНГА и другие серологические реакции для определения антител в сыворотке крови больных туберкулезом к антигенам микобактерий туберкулеза, однако диагностического значения эти реакции не имеют.

Аллергодиагностика. Ставится внутрикожная аллергическая проба (реакция Манту) с туберкулином - очи­щенной белковой фракцией, полученной из фильтрата убитой нагреванием бульон­ной культуры М.tuberculosis. Учет реакции производится через 24-48 часов. Проба используется для оценки течения туберкулезного процесса, определения эффективности вакци­нации и отбора лиц для ревакцинации против тубер­кулеза.

Самостоятельная работа студентов

1. Микроскопическое исследование мокроты больного туберкулезом ( демонстрационный препарат, окраска по Цилю-Нильсену). В поле зрения микроскопа видны одиночные или в виде скоплений микобактерии, окрашенные в рубиново-красный цвет на голубом фоне препарата.

2. Изучение культуральных свойств возбудителя туберкулеза на среде Левенштейна-Йенсена.

3. Определение лекарственной устойчивости возбудителя туберкулеза к химиотерапевтическим средствам на среде Левенштейна-Йенсена.

4. Ознакомление с препаратами, применяемыми для диагностики, лечения и профилактики туберкулеза:

· туберкулин - фильтрат бульонной культуры микобактерий применяемый для постановки внутрикожной аллергической пробы Манту;

· вакцина БЦЖ (BCG – B acterium C almett – G eren); живая вакцина из авирулентного штамма M.bovis, разработанная французскими учеными Кальметтом и Гереном. Применяется внутрикожно для активной специфической профилактики туберкулеза.

· препараты для лечения туберкулеза (стрептомицин, ПАСК, тубазид, фтивазид, метазид, этионамид, этамбутол, пиразинамид, рифампицин, циклосерин, канамицин, фторхинолоны и т.д.)