Изучение морфологии вирусов по электронограммам.

2. Освоение методов обработки материалов для вирусологического исследования, взятых от больных (носоглоточные смывы, испражнения и т.д.). Обязательными этапами этой обработки яв­ляются эмульгирование материала в растворе Хэнкса с последующим цен­трифугированием, отсасыванием надосадочной жидкости и добавлением к ней различных антибиотиков (пенициллин, стрептомицин, нистатин) для угнетения сопутствующей микрофлоры.

3. Освоение этапов приготовления первично-трипсинизированной культуры ткани. Изучить этапы приготовления однослойной. трипсинизированной культуры клеток фибробластов человека. Кусочки эмбриональной ткани измельчить ножницами, пропипетировать в растворе Хенкса, поместить в пробирку, профильтровать. К осадку добавить раствор Хэнкса с трипсином. Пере­мешать осевшие дезагрегированные клетки, перенести на предметное стекло, изучить морфологию живых клеток в препарате "раздавленная капля", подсчитатьих количество в камере Горяева и внести в пробирку со средой 199 для получения монослоя клеток. Пробирки помещаются в термостат при 37⁰ С на сутки для выращивания.

Изучение клеточных культур производится микроскопическим методом. Для этого пробирка помещается на предметный столик микроскопа; монослой клеток должен быть обращен вверх. Микроскопия проводится с вогнутым зеркалом под малым увеличением микроскопа, конденсор опускается вниз. В пробирке виден сплошной рост одноядерннх клеток в виде одного слоя.

4. Освоение методов культивирования вирусов на развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ) - заражение РКЭ в амниотическую, аллантоисную полости, на хорион-аллантоисиую оболочку.

Заражение в хорион-аллантоисную полость. Над отмеченным при овоскопии воздушным мешком производят обработку скорлупы спиртом, водой, затем снова спиртом. При закрытом способе заражения в аллантоисную полость в скорлупе над воздушным мешком делают отверстие стерильной иглой. В него вводят иглу шприца, при этом про­калывается хорион-аллантоисная оболочка и игла погружается в аллантоисную полость на I - 2 мм (от поверхности скорлупы расстояние около 1,5 см), после чего вводят 0,2 мл иссле­дуемого материала. Отверстие в скорлупной оболочке закрывают стерильным парафином.

Заражение на хорион-аллантоисную оболочку. После дезинфекции скорлупы последняя отрезается по краю воздушного мешка, дно которого выстлано белой кожистой подскорлупной оболочкой. Ее уда­ляют стерильным пинцетом, соблюдая осторожность, т.к. под ней расположена прозрач­ная, влажная, с развитыми сосудами хорион-аллантоисная оболочка, на которую наносят исследуемый материал. Дефект в скорлупе закрывают стеклянным колпачком или пластинкой, края которых предварительно погру­жаются в расплавленный парафин.

После заражения обоими способами эмбрион маркируют и помещают в термостат.

5. Экспресс-диагностика вирусных инфекций (обнаружение ви­руса или его компонентов в клиническом матери­але, взятом от больного – демонстрация).

· исследование мазков-отпечатков с целью обнаружения внут­риклеточных включений. Микроскопия мазков-отпечатков с поверхности герпетических язв (окраска по Романовскому-Гимза). Обратить внимание на наличие гигантских многоядерных клеток с внутриклеточными включениями.

· исследование мазков-отпечатков со слизистой оболочки верхних дыхательных путей у больного гриппом иммунофлюоресцентным методом. Обратить вни­мание на светящиеся частицы, располагающиеся внутри клеток.

· обнаружение антигенов вируса герпеса в клиническом материале твердофазным иммуноферментным методом.

· молекулярная гибридизация (выявление вирусов, не раз­множающихся в культуре клеток или персистирующих вирусов - цитомегаловирусов, вирусов герпеса, энтеровирусов, ро-тавирусов и т.д.). Реакция основана на гибридизации комплементарных нитей вирусов с формированием двунитчатых структур. Наличие комплементарных нитей выявляют с помощью зондов, которыми яв­ляются ДНК и РНК, меченые ферментом. При добавления субстрата к зонду с ферментом происходит цветная реакция.

После изучения темы студент должен знать: классификацию вирусов, их основные свойства, методы культивирования вирусов и экспресс-диагностики вирусных инфекций.

Изучив тему, студент должен уметь: заражать и вскрывать куриные эмбрионы, трактовать данные экспресс-диагностики вирусных инфекций.

Тема 13. ОБЩАЯ ВИРУСОЛОГИЯ: ДИАГНОСТИКА ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ. ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ. ИНДИКАЦИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВИРУСОВ. СЕРОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД ДИАГНОСТИКИ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ.

Цель занятия: разбор теоретических основ общей вирусологии (репродукция и генетика вирусов, особенности вирусных инфекций и противовирусного иммунитета);знакомство с методами индикации и идентификации вирусов, серологическими реакциями, применяемыми для диагностики вирусных инфекций.

Перечень конкретных учебно-целевых вопросов

1. Репродукция вирусов. Основные стадии взаимодействия вирусов с клеткой: адсорбция, характеристика вирусных лигандов и клеточных рецепторов; проникновение в клетку, механизмы; депротеинизация; синтез вирусных макромолекул; сборка вирионов; выход из клетки, пути вы­хода.

2. Интерференция. Дефектные интерферирующие частицы и их значение в развитии вирусной инфекции. Вирусы-сателлиты. Интегративная инфекция.

3. Генетика вирусов. Значение вирусологии в развитии генетики. Организация генетического аппарата вирусов. ДНК и РНК – носители генетической информации.

4. Генетическая изменчивость вирусов: мутации и рекомбинации. Мутации, причины возникновения. Фенотипические проявления. Генетические взаимодействия между вирусами. Рекомбинация. Генетическая реактивация. Модификационная изменчивость вирусов: компле­ментация и фенотипическое смешивание.

5. Патогенетические особенности вирусных инфекций. Инфекционность вирусных нуклеиновых кислот. Острая и персистирующая вирусная инфекция.

6. Индикация вирусов на биологических моделях. Характеристика цитопатогенного действия вирусов в культурах клеток. Вирусные включения. Бляшкообразование под агаровым покрытием. Гемадсорбция.

7. Идентификация вирусов с помощью реакций иммунитета – РН, РСК, РТГА, РП, ИФА, РИА, РИФ и др.

8. Методы лабораторной диагностики вирусных инфекций: микроскопический, вирусологический, серологичес­кий, молекулярно-генетические (ПЦР, молекулярная гибридизация).

9. Особенности противовирусного иммунитета.

Методы выявления (индикация) и идентификации вирусов

Перед выявлением вируса в клетках его обычно отделяют от клеток хозяина путем их разрушения с помощью многократного замораживания и оттаивания или растирания со стерильным песком. Полученный вирусосодержащий материал центрифугируют или пропускают через бактериальный фильтр, обрабатывают антибиотиками для деконтаминации и предотвращения бактериального загрязнения.

Индикация вирусов

Для выявления (индикации) вирусов применяются следующие методы.

Индикация вирусов в культуре клеток осуществляется, прежде всего, по цитопатическому действию (ЦПД) вирусов, сроки и характер которого зависят от свойств вируса, проявляясь дегенеративными изменениями клеток с последующей их гибелью и отслаиванием от стекла (рис. 29).

Полная дегенерация клеток сопровождается значительными изменениями в виде пикноза ядра и цитоплазмы, отслаиванием клеточного монослоя от стекла. Частичная дегенерация культур клеток может протекать по следующим типам:

гроздеобразования (округление, увеличение и слияние клеток с образованием гроздевидных скоплений, типично для аденовирусов),

очаговой деструкции (очаги пораженных клеток на фоне в целом сохранившегося монослоя), характерной для вирусов гриппа;

симпластообразования (слияние клеток с образованием гигантских многоядерных клеток в виде симпластов или синцитиев, характерных для вирусов кори, паротита, парагриппа, респираторно-синцитиального, герпеса, иммунодефицита человека).

Пролиферативный тип ЦПД с трансформацией клеток в злокачественные, обладающие неограниченными потенциями к росту, способны вызывать онкогенные вирусы.

Сроки, в течение которых наступает ЦПД, вариабельны (например, 1-2 дня у полиовирусов, 7-14 суток у аденовирусов).

Если в инфицированных культурах клеток ЦПД отсутствует или слабо выражено, проводят «слепые пассажи», т.е. заражают культуральной жидкостью новые культуры клеток.

 

А б

Рис. 29. Культура клеток почек обезьян (а – незараженная, б – цитопатическое действие вируса) х200

Индикация вирусов с помощью реакции гемадсорбции (РГад). Сущность этой реакции заключается в способности эритроцитов человека или животных адсорбироваться на поверхности клеток, инфицированных рядом вирусов (например, орто и парамиксовирусов и др.) в ранние сроки их репродукции (до развития ЦПД) в результате действия гемагглютининов – гликопротеидов, входящих в состав суперкапсида вируса. Для постановки РГад в культуру клеток добавляют 0,2 мл 0,5%-й взвеси эритроцитов, выдерживают 15-20 мин при температуре 4⁰, 20⁰ или 37⁰ С в зависимости от свойств вируса, после чего взвесь эритроцитов удаляют и производят учет реакции под малым увеличе­нием микроскопа по скоплению эритроцитов на отдельных клетках или на всем монослое.

Индикация вирусов по цветной пробе. Принцип метода основан на определении кислых продуктов метаболизма, накаливающихся в клетке в процессе ее жизнедеятельности с помощью индикатора фенолового красного, меняющего свой цвет с красного в щелочной среде на оранжево-желтый в кислой среде. При заражении культуры клеток вирусами, вызывающими ЦПД (например, аденовирусы, энтеровирусы и др.), ме­таболизм клеток подавляется, рН среды не меняется и она остается окрашенной в красный цвет.

Индикация вирусов по внутриклеточным включениям. Репродукция некоторых вирусов (оспы, герпеса, бешенства) приводит к образованию внутриклеточных включений, локализующихся в ци­топлазме или в ядре клеток и представляющих собой скопления вируса (или его антигенов). Включения выявляют путем световой микроскопии культур клеток, окрашенных по Романовскому- Гимзе или другими методами, а также с помощью прямого флюорохромирования (например акридиновым оранжевым) с последующей микроскопией препаратов в люминесцентном микроскопе.

Индикация вирусов с помощью прямой РИФ – выявлениевирусных антигенов, находящихся в инфицированной клетке культуры ткани, с помощью антител диа­гностической иммунной сыворотки, специфических иммуноглобулинов или моноклональных анти­тел, меченых флюорохромом, обычно флюоресцеином (рис. 30).

Индикация вирусов с помощью электронно-микроскопического метода (ЭММ) применяется, в основном, в научных исследованиях. Материал для ЭММ концентрируют различными методами (ультрацентрифугирование, хроматография на колонках, адсорбцией с помощью специальных сор­бентов или антител – для метода иммунной электронной микроскопии). ЭММ позволяет обнаружить в ядре или цитоплазме клеток отдельные вирионы, а также их скопления. В практических целях ЭММ может быть полезен для индикации и идентификации вирусов с типичной морфоло­гией (оспенные вирусы, ротавирусы, коронавирусы, ВИЧ и т.д.).

 

Рис. 30. Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) – выявление вирус-специфических антигенов. х900

Индикация вирусов по образованию бляшек - очагов разрушенных вирусом монослоя культуры клеток под ага­ровым покрытием. Количество бляшек отражает инфекционную активность вируса.

Для постановки этой пробы вирусную суспензию в разных разведениях вносят в культуры ткани, находящиеся в плоских сосудах, после чего монослой клеток заливают гелем (слой агара или бентонита с индикатором нейтральным красным). Время бляшкообразования для большинства вирусов, обладающих ЦПД, варьирует от 36 до 48 ч. Бляшки выглядят в виде неокрашенных светлых пятен на розово-красном фоне окрашенного монослоя. В бентонитовом методе монослой клеток молочного цвета, бляшки прозрачные.

Индикация вирусов в куриных эмбрионах. Зараженные РКЭ инкубируют в термостате при 35- 37⁰ С в течение 48 -72 ч., после чего производят их вскрытие, амниотическую и аллантоисную жидкость отсасывают шприцем, а оболочки и эмбрион извлекают и помещают в стерильные чашки Петри.

При репродукции некоторых вирусов (натуральной оспы, осповакцины, простого герпеса) на ХАО кури­ных эмбрионах появляются характерные бляшки - беловатые пятна диаметром 1-2 мм, количество которых соответствует числу инфекционных ча­стиц.

В аллантоисной и амниотической жидкости зараженных эмбрионов ряд вирусов (например, ортомиксовирусы, парамиксовирусы, аденовирусы и т.д.) может быть выявлен с помощью реакция гемагглютинации (РГА). Принцип реакции состоит в способности гемагглютининов -поверхностных вирусных структур гликопротеидной при­роды этих вирусов склеивать (агглютинировать) эритроциты опреде­ленных видов животных, птиц или человека. РГА не относится к иммунологи­ческим реакциям, поскольку в ее основе отсутствует взаимодействие АГ и AT.

РГА ставят обычно в пробирках или в специальных полистироловых план­шетах. Для этого гото­вят двукратные разведения вирусосодержащего материала на ФР в объеме 0,5 мл. Во все пробирки добав­ляют 0,5 мл 1% взвеси эритроцитов. В контроле к 0,5 мл ФР добавляют аналогичный объем взвеси эритроцитов. Пробы учитывают через 30-60 мин инкубации при комнатной температуре, в термостате при 37⁰ С или в холодильнике при 4⁰ С. Положительная реакция характеризуется выпадением осадка эритроцитов в виде «зонтика» с фестончатыми краями; при отрицательном результате эритроциты оседают в виде компактного осадка («пуговки» - рис. 31). Гемагглютинационный титр (макси­мальное разведение вирусосодержащей жидкости, вызывающее аг­глютинацию эритроцитов - одна гемагглютинирующая единица вируса,1 ГЕ) соответствует концентрации вируса. Агглютинацию эритроцитов могут вызывать также некоторые бактерии (стафилококки, эшерихии, сальмо­неллы, шигеллы, холерный вибрион Эль-Тор), что необходимо учитывать при трактовке результатов РГА при исследовании вирус-содержащего материала, загрязненного бактериальной микрофлорой.

Определение титра вирусов можно проводить также на хорионаллантоисной оболочке.Для этого в лунки стерильных полистироловых пластин помещают кусочки скорлупы 11-12-дневного куриного эмбриона с неповрежден­ной ХАО, добавляют вирусосодержащую жидкость в десятикратных разведениях на буфере, накрывают пластины фоль­гой и инкубируют при 35-37 ⁰ С в течение 24-72 часов. После этого скорлупу удаляют, добавляют 0,5% взвесь куриных эритроцитов и производят учет реакции по эффекту гемагглютинации, который свидетельствует о репродукции вируса.

 

Рис. 31. Реакция гемагглютинации для выявления вируса гриппа в хорион-аллантоисной жидкости куриного эмбриона.

 

Индикация вирусов в организме лабораторных животных находится в зависимости от вируса и вида чувствительного лабораторного животного, будет описана в лабораторной диагностике конкретных вирусных инфекций.

Идентификация вирусов

Проводится с помощью следующих методов.

Учет вирусиндуцированных патологических изменений в чувстви­тельных живых системах.

Изучение антигенных свойств вирусов в серологических реакциях с противовирусными сыворотками является основным методом идентификации вирусов. Для этого используют ряд иммунологических реакций.

Реакция нейтрализации основана на способности антител нейтрализовать инфекционную активность вирусов в культурах ткани, РКЭ, чувствительных лабораторных животных. Из вирус-содержащего материала готовят десятикратные разведе­ния и добавляют к ним специфическую сыворотку в разведении в соответствии с титром, указанным на этикетке ампулы. Смеси вирус-сыворотка инкубируют 30 — 60 мин при 37 °С для обеспече­ния связывания антигенов с антителами, после чего смесью за­ражают культуру ткани, куриные эмбрионы или лабораторных животных. Контролем является чувствительная биосистема, заражен­ная вирусом без сыворотки.

Реакция считается положительной в случае нейтрализации ЦПД в культуре клеток, а также при отсутствии патологических изменений в куриных эмбрио­нах или в организме животных. По результатам РН высчитывается индекс нейтрализации (ИН - отношение титра вируса в контроле к титру вируса в опыте). При ИН менее 10 реакция расценивается как отрицательная, от 11 до 49 — сомнительная, от 50 и выше — положительная.

РН может быть поставлена в наиболее чувствительном варианте - подавления вирусного бляшкообразования под действием вирусспецифической антисыворотки. Для этого к вирус-содержащему материалу добавляют соответствующую искомому вирусу антисыворот­ку и после инкубации в термостате при 37⁰ С течение 30-60 мин смесь вносят в культуру чувствительных клеток. Бляшкообразование выявляют в слое агара или бенто­нита. Идентичность вируса антителам сыворотки проявляется подавлением бляшкообразования.

Другим вариантом РН является цветная проба. Положительный результа­т пробы в случае соответствия вируса противовирусным антителам проявляется блокадой репродукции вируса, клетка при этом остается жизнеспособной, вырабатывая кислые продукты метаболизма, под влиянием которых цвет индикатора (фенолового красного) меняется с красного на желтый. Для постановки пробы в пробирки вносят по 0,25 мл рабочего разведения вируса и соответствую­щую антисыворотку. Смесь выдерживают при комнатной температуре 30-60 мин, добавляют в каждую пробирку по 0,25 мл клеточной суспензии и закрывают их резиновыми пробками. Пробирки инкубируют в термостате при 37⁰ С 6-8 дней, результаты реакции учитыва­ют по изменению цвета индикатора (красный цвет индикатора соответствует щелочному характеру рН - 7,4 указывая на репродукцию вируса и подавление метаболизма клеток; желтый цвет свидетельствует о кислом рН - ниже 7,2 в результате нейтрализации вируса антителами и активном метаболизме клеток с выработкой кислых продуктов обмена).

Реакция торможения гемаггяютинации (РТГА) является одним из вариантов РН и ос­нована на нейтрализации гемагглютинирующих свойств вирусов специфичес­кими антителами, что проявляется отсутствием агглютинации чувствительных эритроцитов с формированием на дне пробирки или лунки полистиролового планшета компактного осадка вместо «зонтика». РТГА используется как для определения антител в качестве метода серологической диагностики, так и для идентификации вирусов, обладающих гемагглютининами. Феномен РТГА проявляется в образова­нии компактного осадка эритроцитов вместо «зонтика» гемагглютинации. Перед постановкой РТГА сыворотки обрабатывают периодатом калия, каолином, бентонитом, ацетоном или други­ми веществами для удаления неспецифических ингибиторов гемагглютинации. После этого к двукратным разведениям сыворотки добавляют равное количество вируссодержащей жидкости с активностью 4 ГЕ, смесь инкубиру­ют 30-60 мин при оптимальной для данного вируса температуре (4⁰, 20⁰, 37⁰ С), а затем добавляют равный объем 0,5-1,0% взвеси эритроцитов. Смесь снова инкубируют 30-45 мин и производят учет результатов реакции. Титром сыворотки считают ее наибольшее разведение, которое вызывает торможение гемагглютинации.

Реакция торможения гемадсорбции (РТГадс) ос­нована на нейтрализации эффекта адсорбции эритроцитов на по­верхности клеток, инфицированных вирусами, способными вызывать гемадсорбцию. Для постановки реакции по 0,2 мл специфической сыворотки, разведенной 1:5, вносят в пробирки, инкубируют 30-60 мин в термостате при оптимальной для данного вируса температуре, затем добавляют по 0,2 мл 0,5% взвеси эритроцитов. Контрольные пробы содержат неиммунную сыворотку и эритроциты. Пробирки снова инкубируют 20-30 мин, после чего производят учет реакции. Идентификация вируса основывается на признаке отсутствия адсорб­ции эритроцитов на клетках в присутствии иммунной сыворотки при наличии гемадсорбции в конт­рольных пробирках.

Для антигенной идентификации вирусов в клетках культу­р тканей используются также РПГ, РСК, РИФ, РОПГА ИФА, РИА со специфическими иммунными противовирусными сыво­ротками или моноклональными AT.

выявление вирусной НК методами генодиагностики с помощью метода молекулярной гибридизации и ПЦР;

электронно-микроскопическое изучение вирусов (см. выше).