Микробиологическая диагностика стрептококковых инфекций.

Микробиологическая диагностика стрептококковыхинфекцийотражена в схеме 2. Выполняются следующие методы исследования.

Бактериоскопический метод – выявление в мазке из гноя патогенных кокков, располагающихся в виде небольших цепочек. Типичное расположение в виде цепочек характерно для чистых культур стрептококка (рис. 2 цветная вкладка).

 

Схема 2. Микробиологическая диагностика стрептококковых инфекций
Материал: гной, раневое отделяемое, пунктаты из полостей и абсцессов, кровь, мокрота, моча, ликвор, рвотные массы, испражнения, остатки пищи.
Микроскопический метод. Выявление грамположительных кокков в виде цепочек в мазках из материала от больного. Бактериологический метод. 1. день. Посев материала на чашки кровяным МПА, пробирки или флаконы с сахарным МПБ. 2 день -учет характера роста колоний (на кровяном МПА - зоны гемолиза, в МПБ –равномерное помутнение). В мазке из колоний в окраске по Граму – кокки в виде цепочек. Оставшуюся часть колонии пересевают на скошенный МПА для получения чистой культуры. Пересев с сахарного МПБ на кровяной МПА	3 день - идентификация выделенной культуры стрептококка, дифференциация основных видов, определение чувствительности к антибиотикам. Выделение чистой культуры с кровяного МПА. 4 день.Заключение о виде стрептококка. Идентификация культуры, выделенной из сахарного МПБ 5 день.Заключение о виде стрептококка, выделенного из сахарного МПБ. Серологический метод Реакция нейтрализации (РН) для определения антистрептолизина-О (гемолизина) и антигиалуронидазы в сыворотке крови больных стрептококковыми инфекциями.

 

Бактериологический метод. Исследуемый материал засевают на кровяной МПА в чашках Петри. После выращивания в термостате при 37⁰ С в течение суток учитывают характер роста колоний (колонии очень мелкие, величиной с булавочную головку, круглые, мутноватые, матовые). Слизистые колонии типичны для свежевыделенных штаммов, стрептококка, матовые – для вирулентных стрептококков с высоким содержанием М-протеина, блестящие – для невирулентных штаммов. На кровяном МПА стрептококки вызывают α–гемолиз (зеленоватая зона вокруг колоний) или β-гемолиз (полностью прозрачная зона гемолиза). Негемолитические стрептококки обычно непатогенны. Из типичных для стрептококка колоний готовят мазок в окраске по Граму и после микроскопии (Streptococcus pyogenes окрашивается по Граму положительно, располагается в виде цепочек) делают пересев в пробирки с сахарным МПБ и кровяным МПА. На 3 день учитывают характер роста (на сахарном МПБ рост стрептококка в виде придонно-пристеночного осадка, сама среда прозрачна), готовят мазок в окраске по Граму и проводят идентификацию выделенной культуры стрептококка по антигенным свойствам. Серогруппу стрептококков определяют в реакциях преципитации, латекс-агглютинации или коагглютинации с целью выявления группоспецифического полисахаридного антигена А, используя группоспецифические сыворотки (обычно групп A, B, C, F, G). Большинство патогенных для человека стрептококков являются β-гемолитическими и относятся к группе A. Серовар выделенной культуры стрептококка выявляют с помощью реакции агглютинации (выявление типового протеинового антигена М, по которому выделяют около 100 сероваров) с типоспецифическими стрептококковыми сыворотками.

Для идентификации β-гемолитических стрептококков применяют PYR-тест (на пирролидониламидопептидазу), CAMP-тест (на белок синергидного гемолиза), тест Фогес-Проскауэра (на образование ацетоина), чувствительность к бацитрацину (0,04 ЕД на диск), галотолерантность (рост в присутствии 6,5% хлорида натрия), гидролиз гиппурата натрия, ферментацию трегалозы, сорбита и т.д. α -гемолитические стрептококки идентифицируют, используя тесты на чувствительность к желчи, оптохину, на гидролиз эскулина и т.д. (табл. 3).

PYR -mecm. В МПБ, содержащий 0,01 % L-пирролидонил- β –нафтиламин, вносят петлю агаровой культу­ры стрептококка, инкубируют при 37⁰ С в течение 4 ч. По­ложительная реакция характеризуется появлением ярко-крас­ного окрашивания после внесения 1 капли специального реактива.

САМР-тест. S. agalactiae вырабатывают внеклеточный протеин синергидного гемолиза, усиливающий лизис эритроцитов β -лизином стафилокок­ка. Для его определения на чашку с кровяным МПА засевают перпендикулярными штрихами исследуемую культуру стрептококка и суточную бульонную культуру стандартного β -гемолитического штамма Staphylococcus aureus. В ка­честве положительного и отрицательного контролей засевают со­ответственно культуры S. agalactiae и S. pyogenes, инкубация 18 ч при 37 ° С. При положительном САМР-тесте на месте пересечения стафилококка и S. agalactiae появляется зона усиления гемолиза в виде «крыла бабочки».

Таблица 3. Дифференциальные признаки стрептококков

Свойства	Микроорганизмы
S. pyogenes	S. agalactiae	Стрептококки групп C и G	S. bovis
Вид гемолиза	Β	β, α	β	α,
Гидролиз гиппурата натрия	-	+	-	-
CAMP-тест	-	+	-	-
PYR-тест	+	-	-	-
Желчно-эскулиновый тест	-	-	-	+
Рост в солевом МПБ	-	+	-	-
Чувствительность к бацитрацину	+	-	-	-
Чувствительность к сульфаметоксазолу и триметоприму	-	-	+	+

Обозначения: (+) - постоянный признак, (-) – отсутствие признака

Исследование крови. Для выделения гемокультуры посев обычно производят в сахарный бульон. При нали­чии стрептококка на дне флакона появляется хлопьевидный при­донный осадок, а в мазках обнаруживаются длинные цепочки стреп­тококков. Для выделения чистой куль­туры и определения характера гемолиза делают пересев в чашку с кровяным агаром. Через сутки (3-й день исследования) появляют­ся типичные мелкие колонии, окруженные зоной гемолиза. Даль­нейший ход исследования аналогичен описанному выше.

Генодиагностика. Разработан метод ДНК-ДНК-гибридизации для обнаружения специфических фрагментов ДНК стрептококка в исследуемом материале, что дает основание поставить предварительный диагноз стрептококковой инфекции.

Серодиагностика (определение антител к гемолизину – стрептолизину-О) проводится при подозрении на ревматизм. Сущность реакции заключается в нейтрализации антителами сыворотки крови больного гемолитической активности стрептококкового стрептолизина-О. Титр антистрептолизина-О у здоровых людей – до 250 АЕStO. При ревматизме с первых дней болезни титр антистрептолизина-О составляет 500 АЕStO и выше.

Самостоятельная работа студентов

1. Микроскопия мазка из чистой культуры Streptococcus pyogenes (демонстрационный микропрепарат, окраска по Граму). Клетки стрептококка круглые, располагаются в виде цепочек, по Граму окрашиваются положительно.

2. Микроскопия мазка из чистой культуры энтерококка - Streptococcus faecalis (демонстрационный микропрепарат, окраска по Граму). Клетки энтерококка овальные, располагаются в виде коротких цепочек, по Граму окрашиваются положительно.

3. Знакомство с культуральными свойствами стрептококков. На кровя­ном МПА стрептококки образуют мелкие, мутные, круглые колонии с прозрачной зоной гемолиза вокруг. На сахарном МПБ характерен придонно-пристеночный рост в виде зернистого осадка, среда остается прозрачной.

4. Определение серогруппы (демонстрация реакции латекс-агглютинации с солянокислым экстрактом исследуемой культуры и группоспецифическими сыворотками A,B,C,D), серовара стрептококка (реакция агглютинации исследуемой культуры с типоспецифическими стрептококковыми сыворотками 5,12, 23).

5.. Знакомство с препаратами, используемыми для диагностики, профилактики и лечения стафилококковых и стрептококковых инфекций.

- стрептококковый бактериофаг - фильтрат фаголизата стрептококка. Применяется наружно, внутрикожно, внутримышечно для лечения стрептококковых инфекций

Микробиологическая диагностика заболеваний, вызываемых гноеродными