Дифтерия и туберкулез. Лабораторная диагностика

Занятие № 2.2.3

Дифтерия и туберкулез. Лабораторная диагностика

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ:

изучить биологические свойства коринебактерий и патогенных микобактерий, принципы лабораторной диагностики дифтерии и туберкулеза. Классифицировать препараты для идентификации, лечения и профилактики дифтерии и туберкулеза

 

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ЗНАТЬ:

1. Характеристику биологических свойств возбудителей дифтерии.

2. Эпидемиологию, патогенез, восприимчивость и иммунитет при дифтерии.

3. Основные клинические проявления дифтерии

4. Характеристику биологических свойств возбудителей туберкулеза.

5. Эпидемиологию, патогенез, восприимчивость и иммунитет при туберкулезе

6. Основные клинические проявления туберкулеза.

7. Принципы лабораторной диагностики.

8. Препараты для идентификации, лечения и профилактики заболеваний.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН УМЕТЬ:

· дифференцировать возбудителей дифтерии и туберкулеза по морфологическим, тинкториальным, биохимическим и токсигенным свойст­вам;

· интерпретировать результаты серологических реакций;

· классифицировать препараты в соответствии с их назначением.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ВЛАДЕТЬ:

• алгоритмом лабораторной диагностики инфекционных болезней;

 

• методами анализа и оценки результатов лабораторной диагностики по выявлению коринебактерий и патогенных микобактерий.

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ДИФТЕРИИ

БАКТЕРИОСКОПИЯ

Работа № 1. Морфологические и тинкториальные свойства коринебактерий

Цель: изучить морфологические и тинкториальные свойства коринебактерий.

Самостоятельная работа: микроскопировать готовые препараты - мазки. Зарисовать. Сделать вывод.

Corynebacterium diphtheriaе (простой способ окраски по Леффлеру)

Результат:_________________________________________________

__________________________________________________________

__________________________________________________________

__________________________________________________________

 

 

Corynebacterium diphtheriaе (сложный способ окраски - по Нейссеру)

Результат:__________________________________________________

___________________________________________________________

___________________________________________________________

___________________________________________________________

 

Дифтероиды

Результат:__________________________________________________

___________________________________________________________

___________________________________________________________

 

 

Вывод:__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

 

БАКТЕРИОЛОГИЯ

Работа № 2. Культуральные свойства возбудителей дифтерии

Цель: изучитькультуральные свойства возбудителей дифтерии.

Самостоятельная работа: описатьхарактер роста возбудителей дифтерии на плотной питательной среде. Сделать вывод.

Среда Клауберга (элективная среда)

Результат:__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

___________________________________________________________

___________________________________________________________

 

Вывод:__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Работа № 3. Дифференциация коринебактерий

Цель: научиться дифференцировать дифтерийную палочку от дифтероидов.

Самостоятельная работа: на основании биохимических свойств и пробы на токсигенность, как основного признака возбудителя дифтерии дифференцировать дифтерийную палочку от дифтероидов. Сделать вывод.

Проба Пизу (на цистиназу)

 

 

«к»

 

«о» «к» «о» «к» «о» «к»

дифтерийная палочка ложнодифтерийная

палочка ксерозы палочка

Результат:_____________________________________________________________________

____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Проба Закса (на уреазу)

«о» «к» «о» «к» «о» «к»

дифтерийная палочка ложнодифтерийная

палочка ксерозы палочка

Результат:_____________________________________________________________________

____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________

Ферментация углеводов

глю сах крах глю сах крах

дифтерийная палочка дифтерийная палочка

gravis mitis

глю сах крах глю сах крах

 

палочка ксерозы ложнодифтерийная палочка

Результат:_____________________________________________________________________

____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________

Проба на токсигенность

_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________________________________________________

 

Дифференциация дифтерийной палочки от дифтероидов

 

Виды	Ферментация	Уреазная актив-ность	Цистиназ-ная активность	Токсиген ность
	глюкоза	сахароза	крахмал
Дифтерийная палочка а) gravis   б) mitis
Дифтероиды: а) ложнодифтерий- ная палочка   б) палочка ксерозы

 

Вывод:____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

СЕРОДИАГНОСТИКА

Работа № 4. Серологические исследования

 

Цель: оценить напряженность коллективного антитоксического иммунитетас помощью основного метода диагностики – РПГА.

Самостоятельная работа: учесть готовый результат РПГА, поставленной с сывороткой больного и эритроцитарным дифтерийным антигенным диагностикумом для определения уровня антитоксического иммунитета. Записать вывод.

 

Направление:___________________________________________________________________

Ингредиенты:____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

 

Механизм:

 

Постановка:

1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 КС КД

 

Результат:____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

 

Вывод:____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Работа № 5. Принципиальная схема лабораторной диагно­стики дифтерии

Цель: изучить особенности лабораторной диагностикидифтерии.

Самостоятельная работа: составить схему лабораторной диагностики дифтерии.Отметить наибо­лее информативные методы лабораторной диагностики.

 

Исследуемый материал:

____________________

____________________

____________________

 

 

БАКТЕРИОСКОПИЯ

А) Mycobacterium tuberculosis в мазке из мокроты.

Окраска по Цилю-Нильсену.

Результат:_________________________________________________

__________________________________________________________

__________________________________________________________

__________________________________________________________

Вывод:____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

БАКТЕРИОЛОГИЯ

СЕРОДИАГНОСТИКА

САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА ВО ВНЕУРОЧНОЕ ВРЕМЯ

I. Классифицировать предложенные антимикробные препараты в соответствии с их назначением (профилактические, диагностические, лечебные).

1.АД-анатоксин

2._____________________________________________________________________________

3._____________________________________________________________________________

4._____________________________________________________________________________

5._____________________________________________________________________________

6._____________________________________________________________________________

 

Токсин Шика

2._____________________________________________________________________________

3._____________________________________________________________________________

4._____________________________________________________________________________

5._____________________________________________________________________________

6._____________________________________________________________________________

1.Вакцина БЦЖ

2._____________________________________________________________________________

3._____________________________________________________________________________

4._____________________________________________________________________________

5._____________________________________________________________________________

6.____________________________________________________________________________

Туберкулин

2._____________________________________________________________________________

3._____________________________________________________________________________

4._____________________________________________________________________________

5._____________________________________________________________________________

6._____________________________________________________________________________

Стрептомицин

2._____________________________________________________________________________

3._____________________________________________________________________________

4._____________________________________________________________________________

5._____________________________________________________________________________

6._____________________________________________________________________________

Канамицин

2._____________________________________________________________________________

3._____________________________________________________________________________

4._____________________________________________________________________________

5._____________________________________________________________________________

6._____________________________________________________________________________

Фтивазид

2._____________________________________________________________________________

3._____________________________________________________________________________

4._____________________________________________________________________________

5._____________________________________________________________________________

6._____________________________________________________________________________

II. Заполнить контрольные карты по нозоформам:

 

ДИФТЕРИЯ

 

Таксономия возбудителя:

Семейство__________________________________________________________________

Род________________________________________________________________________

Вид________________________________________________________________________

Морфологические и тинкториальные свойства __________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Культуральные и биохимические свойства ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Резистентность _________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Эпидемиология

Источник инфекции_____________________________________________________________________

Механизм передачи______________________________________________________________________

Пути передачи___________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Факторы передачи___________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Патогенез и клиника

Входные ворота________________________________________________________________________

Инкубационный период_______________________________________________________________________

Основные факторы патогенности ________________________________________________

_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Основные фазы патогенеза_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

 

Клинические симптомы_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Иммунитет___________________________________________________________________

Основные направления лабораторной диагностики_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Специфическая профилактика (препараты)____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Лечение (препараты)_______________________________________________________________________________________________________________________________________________

ТУБЕРКУЛЕЗ

 

Таксономия возбудителя:

Семейство__________________________________________________________________

Род________________________________________________________________________

Вид________________________________________________________________________

Морфологические и тинкториальные свойства _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Культуральные и биохимические свойства ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Антигенная структура ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Резистентность _________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Эпидемиология

Источник инфекции_____________________________________________________________________

Механизм передачи______________________________________________________________________

Пути передачи___________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Факторы передачи___________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Патогенез и клиника

Входные ворота________________________________________________________________________

Инкубационный период_______________________________________________________________________

 

Основные факторы патогенности ________________________________________________

_____________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________

 

Основные фазы патогенеза________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________

Клинические симптомы_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

 

Иммунитет___________________________________________________________________

Основные направления лабораторной диагностики _________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Специфическая профилактика (препараты) ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Лечение (препараты) _______________________________________________________________________________________________________________________________________________

ЗАДАЧИ

1. В инфекционную больницу поступила девочка 2-х лет с высокой температурой, жалобами на боли в горле. На слизистой зева с трудом снимающиеся серовато-белые налеты. Лечащий врач поставил диагноз «дифтерия зева», ввел немедленно 5000 МE противодифтерийной сыворотки и отправил в лабораторию материал для исследования.

Оцените результат бактериологического исследования.

Вопросы 1. Какой материал взят на исследования? 2. Какие исследования назначить?

3. Подтвердился ли клинический диагноз «дифтерия»? Почему? 4. Правильна ли была тактика лечащего врача? Почему?

2. Всем детям начальной школы была своевре­менно проведена ревакцинация дифтерийным анатоксином. Спу­стя 2 месяца одна ученица заболела дифтерией. Для оценки уров­ня антитоксического иммунитета в коллективе была поставлена РПГА. Оценить результаты РПГА при обследовании школьни­ков. Оформить протокол исследования. Сделать вывод.

(Для учета результатов исследования выделяется планшет с реакцией РПГА.)

Вопросы 1. У кого из обследованных школьников напряженный антитоксический иммунитет к дифтерии? Почему? 2. Кому из обследованных не­обходимо ввести специфический препарат? Какой? Почему? 3. Как объяснить причину заболевания дифтерией одной уче­ницы?

 

 

Обследуе-мые школьники	Метод диагнос­тики	Иссле­дуемый материал	Диагностичес­кий препарат для РПГА	Разведения сыворотки	Единица измерения активно­сти анатоксина
1/100	1/200	1/400	К
А. Б. Е.	Сероло­гичес­кий	Сыво­ротка крови	Дифтерий­ный эритроци-тарный диагностикум	+ + -	+ - -	+ - -	- - -	ИЕ - иммуногенная единица
				«+» - склеенные эритроциты в виде «зонтика» «-» - отсутствие гемагглюти-нации - «пуговка»

3. В туберкулезном диспансере при лабораторном обследо­вании семьи, состоящей из девочки 7 лет и трех взрослых лю­дей (матери, отца и дяди ребенка), установлено следующее:- у девочки положительная реакция Манту, Микроскопия мокроты, посев ее и биологическая проба дали отрицательные результаты.

- у матери обнаружены туберкулезные палочки только в посеве мокроты.

- у отца туберкулезная палочка обнаружена при микроско­пии мокроты.

- у брата матери - положительная реакция Манту, резуль­таты всех остальных исследований отрицательные.

 

 

Обследуемые	Реакция Манту	Микроскопия мокроты	Посев мокроты	Биологическая проба
Ребенок	+	-	-	-
Отец	-	+	Не проводился	-
Мать	-	-	+	Не проводилась
Брат матери	+	-	-	-

Вопросы: 1. У кого из них лабораторно подтверждается ди­агноз «туберкулез»? 2. Кто из них должен быть оставлен под на­блюдением врача диспансера?

 

4. В инфекционную больницу поступила девочка 2-х лет с высокой температурой, жалобами на боли в горле. На слизистой зева с трудом снимающиеся серовато-белые налеты. Лечащий врач поставил диагноз дифтерия зева, ввел немедленно 5000 МE противодифтерийной сыворотки и отправил в лабораторию материал для исследования.

Оцените результат бактериологического исследования.

Вопросы 1.Какой материал взят на исследования? 2. Какие исследования назначить?

3.Подтвердился ли клинический диагноз дифтерии? Почему? 4.Правильна ли была тактика лечащего врача? Почему?

Пример решения задачи

Всем детям начальной школы была своевре­менно проведена ревакцинация дифтерийным анатоксином. Спу­стя 2 месяца одна ученица заболела дифтерией. Для оценки уров­ня антитоксического иммунитета в коллективе была поставлена РПГА. Оценить результаты РПГА при обследовании школьни­ков. Оформить протокол исследования. Сделать вывод.

Для учета результатов исследования выделяется планшет с реакцией РПГА.

Вопросы 1. У кого из обследованных школьников напряженный антитоксический иммунитет к дифтерии? Почему? 2. Кому из обследованных не­обходимо ввести специфический препарат? Какой? Почему? 3. Как объяснить причину заболевания дифтерией одной уче­ницы

Обследуемые школьники	Метод диагнос­тики	Иссле­дуемый материал	Диагностичес­кий препарат для РПГА	Разведения сыворотки	Единица измерения активно­сти анатоксина
1/100	1/200	1/400	К
А. Б. Е.	Сероло­гичес­кий	Сыво­ротка крови	Дифтерий­ный анатоксинный эритроци-тарный диагностикум	+ + -	+ - -	+ - -	- - -	ИЕ-имму- ногенная единица
				«+» - склеенные эритроциты в виде «зонтика» «-» - отсутствие гемагглютинации -«пуговка»

 

Решение. Студент учитывает данные ему результаты, за­полняет протокол и делает выводы:

1. Напряженный антитоксический иммунитет к дифтерии выявлен только у школьника А., так как по результатам РИГА в сыворотке крови обследуемого обнаружен высокий титр ан­титоксических антител (1/400).

2. Обследуемым детям Б. и Е., у которых не выявлен напря­женный иммунитет, необходимо провести вакцинопрофилактику путем введения дифтерийного анатоксина, для того чтобы создать напряженный антитоксический иммунитет.

3. Объяснить причину заболевания одной из учениц в школе можно отсутствием у ней напряженного антитоксиче­ского иммунитета против дифтерии. Возможные причины: врожденный иммунодефицит, вторичный иммунодефицит, слабая экспрессия генов иммунного ответа, отсутствие вакци­нации.

Подпись преподавателя _________________________________________________________

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ СПРАВКА

Возбудитель дифтерии

Культуральные свойства

Наиболее характерные колонии на среде Клауберга II с добавлением теллурита калия или натрия (элективная среда для выращивания С. diphtheriae). Они вырастают в виде почти черных колоний, выделяющихся на красном фоне среды. Цвет колоний обусловлен способностью С. diphtheriae в процессе роста восстанавливать теллуристый калий до элементарного теллура.

Микробы дифтерии не являются однородными по своим культурально - биохимическим свойствам и подразделяются на биовары gravis, mitis и intermedius. На среде Клауберга II через 48 часов бактерии биовара gravis вырастают в виде круглых (d 1,5- 2 мм) колоний с неровными краями, часто имеют приподнятый центр и радиальную исчерченность. Колонии серовато-черного цвета, напоминают маргаритки. Вариант mitis дает круглые выпуклые колонии черного цвета (d 1- 1,5 мм) с ровными краями. Вариант intermedius занимает промежуточное положение. Дает черные выпуклые с блестящей поверхностью колонии.

Серодиагностика дифтерии

Антитела к С. diphtheriae определяют в крови больных, начиная с первых дней болезни и повторно через 10-14 дней. Обязательным условием является определение специфических антител в динамике болезни в парных сыворотках. Диагностическое значение имеют результаты серологических исследований при нарастании титра антител не менее чем в 3-4 раза.

Для определения уровня дифтерийного антитоксина в сыворотке человека применяют несколько реакций:

РПГА

РПГА - двухкомпонентная реакция, предполагающая взаимодействие диагностикума эритроцитарного дифтерийного антигенного (представляет собой эритроциты с адсорбированным на них дифтерийным анатоксином) и антитоксических противодифтерийных антител, находящихся в сы­воротке крови обследуемых. При наличии в исследуемой сыворотке антитоксина образуется специфический комплекс: антитоксин + сенсибилизированные анатоксином э ритроциты. В результате формируется осадок в виде агглютината эритроцитов.

В нашей странеРПГА рекомендована в качестве основного метода для определения напряженности антитоксического иммунитета к С. diphtheriae, а также для оценки вакцинального иммунитета.

Оценка состоянияколлективного иммунитета требует более детальной характеристики, чем только установление процента серонегативных людей. Для этого следует давать развернутыепо каждому титру данные в РНГА т.е. с учетом степени напряженности. Отсутствие антител является безусловным показателем незащищенности; титры 1:10 и 1:20 можно считать индикатором пограничного иммунитета, не обеспечивающего безусловной защиты; однако заболевание при этом, как правило, протекает в легкой форме без летального исхода. Титры 1:80 и выше являются показателем защищенности группы.

Таким образом, процентное распределение показателей титров в каждом разведении дает качественную характеристику состояния иммунитета к дифтерии в обследованной группе. Например, выявление у 50% обследованных показателей пограничного иммунитета (титры 1:10, 1:20) свидетельствует о слабой защищенности группы, в которой с годами будет увеличиваться число лиц, не защищенных от дифтерии.

В настоящее время приняты следующие количественные критерии, характеризующие степень восприимчивости к дифтерии в зависимости от уровней антитоксических антител.

Содержание антитокси­ческих антител	Интерпретация результатов
< 0,01МЕ/мл	обследуемый восприимчивк дифтерии
0,01 МЕ/мл	минимальный уровень циркулирующих антител, обеспечивающий некоторуюстепень защиты
0,01-0,09 МЕ/мл	уровни циркулирующих антитоксических анти­тел, обеспечивающие некоторуюстепень защиты
0,1 МЕ/мл	защитный уровень циркулирующих антител
> 1,0 МЕ/мл	уровень антитоксина, обеспечивающий стойкуюдлительную невосприимчивость к дифтерии

ИФА

ИФА предназначен дляколичественного определения антибактериальных и антитоксических иммуноглобулинов М, G человека в сыворотке крови больных дифтерией, бактерионосителей издоровых людей. Принцип ИФА основан на образовании специфического комплекса антиген-антитело, выявляемого с помощью второго антитела, меченного пероксидазой хрена. При последующем добавлении субстратной смеси развивается ферментативная реакция, регистрируемая по появлениюокрашенного продукта. Интенсивность реакции учитывается с помощью иммуноферментного анализатора или визуально.

3. Определение титра антител к дифтерийному токсину в сыворотке крови человека в реакции нейтрализации (РН) на культуре клеток.

Метод основан на том, что метаболическая активность и рост клеток культуры ингибируется дифтерийным токсином, который, в свою очередь, может быть нейтрализован антитоксином, содержащимся в сыворотке крови. Последовательное разведение сыворотки крови человека добавляют в лунки микропланшета, в которые затем вносят дифтерийный токсин в рабочей дозе и культуру клеток. Обнаружение по окончании инкубации (t 37^оС 5-6 суток) живых клеток культуры в лунках, содержащих определенные разведения сывороток, будет указывать на соответствующий титр антител к дифтерийному токсину в тестируемых сыворотках + проба на токсигенность.

Серодиагностика

Для выявления специфических антител к антигенам микобактерий предложено большое количество серологических реакций: РПГА, РА, РСК.

В последние годы интенсивно разрабатываются тесты на выявление антител к МБТ в крови больного в конкурентной иммуноферментной реакции с применением стандартных концентраций антигена микобактерий и моноклональных антител, конъюгированных с ферментом - пероксидазой. Разработаны диагностические тест-системы "ИФА - туберкулез", предназначенные для выявления с помощью иммуноферментного анализа антител к МБТ и позволяющие распознавать как легочные, так и внелегочные формы туберкулеза. Тест-система "ИФА-туберкулез" может быть использована как для диагностики у отдельных больных, так и при массовых обследованиях населения. Чувствительность тест-системы при различных локализациях туберкулезного процесса составляет от 68% до 100%, специфичность - 94%.

 

Занятие № 2.2.3

Дифтерия и туберкулез. Лабораторная диагностика

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ:

изучить биологические свойства коринебактерий и патогенных микобактерий, принципы лабораторной диагностики дифтерии и туберкулеза. Классифицировать препараты для идентификации, лечения и профилактики дифтерии и туберкулеза

 

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ЗНАТЬ:

1. Характеристику биологических свойств возбудителей дифтерии.

2. Эпидемиологию, патогенез, восприимчивость и иммунитет при дифтерии.

3. Основные клинические проявления дифтерии

4. Характеристику биологических свойств возбудителей туберкулеза.

5. Эпидемиологию, патогенез, восприимчивость и иммунитет при туберкулезе

6. Основные клинические проявления туберкулеза.

7. Принципы лабораторной диагностики.

8. Препараты для идентификации, лечения и профилактики заболеваний.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН УМЕТЬ:

· дифференцировать возбудителей дифтерии и туберкулеза по морфологическим, тинкториальным, биохимическим и токсигенным свойст­вам;

· интерпретировать результаты серологических реакций;

· классифицировать препараты в соответствии с их назначением.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ВЛАДЕТЬ:

• алгоритмом лабораторной диагностики инфекционных болезней;

 

• методами анализа и оценки результатов лабораторной диагностики по выявлению коринебактерий и патогенных микобактерий.