Цитологическое исследование мазков, соскобов и отпечатков

Традиционными методами, используемыми па­тологоанатомами для диагностики различных заболеваний, являются цитологическое иссле­дование мазков, соскобов и отпечатков тка­ни из различных органов и морфологическое изучение замороженных или заключённых в парафин биоптатов органов и тканей. Цито­логические исследования позволяют дать пред­варительный диагноз в течение 20—30 мин, они широко применяются в поликлинической и хирургической практике. Однако при цитоло­гическом исследовании нарушаются взаимо­отношения между различными клетками и внеклеточным матриксом. Кроме того, в ци­тологическом образце могут отсутствовать от­дельные типы клеток. Поэтому цитологичес­кие данные часто носят предварительный характер, а окончательный диагноз ставят после морфологического исследования биоптата че­рез 4—5 дней. Использование срезов, получен­ных из замороженной ткани (криостатных сре­зов), позволяет ускорить обработку материала до 1—2 ч, но за счёт ухудшения морфологичес­кой картины. В связи с этим исследование биопсийного материала, заключённого в парафин, остаётся основным подходом в патологоанатомической диагностике. Очень информативна иммуноцитохимия. Используя специфические AT и эффективные системы их визуализации, можно получить данные, опре­деляющие выбор терапии заболевания и его прогноз. Особенно эффективно использование этих методик при диагностике опухолей, иммунных, аутоиммунных и воспалительных про­цессов.

Авторадиография

Близка к гастохимическим методам исследова­ния авторадиография, основанная на выявле­нии в клетках и в субклеточных структурах в СМ или ЭМ локализации радиоактивных изо­топов. Метод позволяет визуально оценить ин­тенсивность метаболизма в клетках и во внут­риклеточных структурах, а также в структурах различных микробных и вирусных возбудите­лей болезней. Авторадиография позволяет на­блюдать динамику процессов метаболизма, так как α- и β-частицы используемых изотопов, локализуясь и перемещаясь в определённых структурах, оставляют след на фотоэмульсии, которой покрывают гистологический или ультратонкий срез ткани.

МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Бурное развитие и прогресс в области имму­нологии, генетики, биотехнологии, клеточной и молекулярной биологии привели к дальней­шему совершенствованию методического ар­сенала патолога. В области цитологии появи­лись цитологические центрифуги (цитоспины), позволяющие сконцентрировать клетки из раз­личных биологических жидкостей и получить качественный клеточный монослой, пригодный для цитологического и иммуноцитологического исследований в минимальные сроки.

Проточная цитофлюориметрия

Важным достижением в области цитологии явилось использование проточной цитофлюориметрии. Проточный цитофлюориметр — прибор, по­зволяющий производить качественный и ко­личественный анализы физических и биоло­гических параметров клеток, фенотипирование лейкоцитов, ДНК-анализ. Прибор автоматичес­ки измеряет количество света из флюорохрома, связанного со специфическими AT (CD3, CD4, CD8, CD19 и т.д.) или определёнными веществами (например, этидиумом бромида — 4',6-диамидино-2-фенилиндолом [DAPI]), ок­рашивающими ДНК или РНК. Используя раз­личные флюорохромы, можно получить многопараметровые данные из одного образца. Сигнал из каждой клетки собирается в течение нескольких микросекунд при прохождении клетки через лазерный пучок, обрабатывается компьютером и представляется на дисплее в виде количественных данных. Образцы, содер­жащие суспензию или мелкие агрегаты клеток, готовятся в течение 2—3 ч. Наиболее широко проточная цитофлюориметрия стала использо­ваться в цитологической практике после раз­вития ультразвуковой диагностики и примене­ния техники тонкоигольчатой аспирационной биопсии. В отличие от обычной биопсии, тон­коигольчатая аспирационная биопсия менее травматична, не требует специальной подго­товки больного и стерильных условий. Из по­лучаемого аспирационного материала готовят мазок для цитологического исследования и клеточную суспензию для проточной цитофлюориметрии. Недостатком тонкоигольчатой аспирационной биопсии является её меньшая информативность и невозможность получения суспензии клеток из солидных тканей для про­точной цитофлюориметрии.

Метод двойной или тройной метки

Совершенствование систем визуализации флю­оресцентных и ферментных меток позволило использовать несколько помеченных разными метками различных AT на одном препарате при иммуногистохимическом исследовании. Это метод двойной или тройной метки.

Этот методический подход особенно важен при исследовании гетерогенной по составу ткани и позволяет выявить распределение различных популяций клеток при инфильтративном росте опухолей, развитии локального иммунного от­вета и т.д. При определённых условиях одна и та же клетка может экспрессировать несколько Аг (коэкспрессия), выявляемых обычно на раз­личных клетках. В таких случаях используют флюоресцентный микроскоп, изображение с которого передаётся в компьютер.

Ещё более эффективно исследование таких препаратов с помощью конфокальной сканирующей лазер­ной микроскопии. Монохромный источник освещения (лазер) не даёт оптических искаже­ний и позволяет сканировать клетки в срезе или мазке в одной плоскости на различной глубине. Специальная компьютерная программа позво­ляет совмещать изображения одних и тех же участков, содержащих клетки с различными флюорохромами, и анализировать распреде­ление различных меток на клетках. При совпа­дении меток и наложении их друг на друга по­является псевдоцветное свечение жёлтого цвета.

Гибридизация in situ

В последнее десятилетие в патологии активно используют гибридизационную иммуногистохимию, или гибридизацию in situ. Эта техника, в отличие от описанных выше, способна про­демонстрировать распределение специфичес­ких последовательностей ДНК или РНК в индивидуальных клетках на срезах ткани, в мазке, в культуре клеток, хромосомных препа­ратах.

Гибридизация in situ способна определять 20—50 копий определённых последовательностей ДНК или РНК в одной клетке. Таким обра­зом, этот метод позволяет судить о биосинте­тической активности отдельных клеток при их прямой визуализации и широко используется в диагностике инфекционных заболеваний и неопластических процессов, включая онкоге­ны, гены-супрессоры, ростовые факторы и факторы, регулирующие клеточный цикл. Напри­мер, эта техника используется для идентифика­ции экспрессии РНК в опухолях эндокринной системы, негативных при иммуногистохимической окраске. Гибридизация in situ является также важным инструментом в мониторинге генной терапии, поскольку позволяет выявлять лока­лизацию и распределение терапевтических ге­нов, трансфецированных вирусными или плазмидными векторами в клетки или органы. Недостатком гибридизации in situ является её относительно низкая чувствительность. Этот недостаток с успехом компенсируется исполь­зованием полимеразной цепной реакции.

Полимеразная цепная реакция

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — метод, в основе которого лежит ферментное накопле­ние специфических ДНК-последовательностей. В ПЦР используются олигонуклеотидные праймеры (короткие ДНК-последовательности), ко­торые располагаются сбоку от цепи ДНК и тем самым определяют интересующую область в исследуемой ДНК. Процедура включает повторные серии циклов, каждый из которых состоит из шаблонной денатурации, отжига праймера и удлинения прай-мера термостабильной ДНК-полимеразой до создания экспоненциального накопления спе­цифического фрагмента ДНК, конец которого определяется 5'-концом праймера. После 20 циклов количество копий возрастает в 10⁶—10⁸ раз. Для ПЦР, помимо ДНК, может быть в качест­ве стартового материала использована РНК. Эта процедура известна как ПЦР с обратной транскрипцией. При помощи обратной транс­крипции происходит построение комплементар­ной ДНК, которая и определяется ПЦР. ПЦР является чрезвычайно чувствительным методом, способным увеличивать 1—2 копии генов до уровня, легко определяемого гель-электрофоре­зом или блот-гибридизацией по Э. Саузерну (англ. название метода — southern blotting). Эта по­вышенная чувствительность ПЦР часто способ­на давать ложноположительные результаты при контаминации образцов. Современная лабора­торная техника максимально предотвращает подобное загрязнение. Наиболее важным правилом ПЦР является раздельное проведение пре- и пост-ПЦР этапов. Кроме того, каждая ПЦР включает негативный ПЦР-контроль

В настоящее время ПЦР получила дальней­шее развитие в виде ПЦР в реальном времени, способной давать количественную оценку ис­следуемых нуклеиновых кислот. При про­ведении ПЦР требуется разрушение клеток и тканей для изоляции нуклеиновых кислот и пе­ревода их в жидкую фазу. Следовательно, ре­зультаты ПЦР невозможно связать с конкретным гистологическим типом клетки, определить про­цент клеток, содержащих исследуемую последо­вательность.

Молекулярная техника, объединившая высокую чувствительность ПЦР и клеточную локализа­цию последовательностей, выявляемых гибри­дизацией in situ, получила название ПЦР in situ. Часто эта техника используется для определения вирусных или провирусных последовательнос­тей нуклеиновых кислот. Помимо этого, ПЦР in situ применяют для изучения эндогенных пос­ледовательностей ДНК, включая перестроение клеточных генов, хромосомные транслокации и картирование геномных последовательностей с небольшим числом копий в метафазных хромо­сомах. Однако эта техника не находит широкого применения из-за лёгкости получения псевдоположительного результата и необходимости проведения большого количества контролей, сложности интерпретации полученных резуль­татов и их низкой воспроизводимости.

Микродиссекция

В связи с вышеизложенным, был предложен ме­тод микродиссекции, позволяющий вырезать отдельные идентифицированные клетки или группы клеток с последующим их анализом с помощью обычной ПЦР. Первые шаги в этом направлении были сделаны путём вырезания бритвой или соскобов интересующих участков ткани на срезе под микроскопом. В дальней­шем стали использовать микроманипуляторы, позволяющие точно выделить отдельные скоп­ления клеток. В обоих методах процесс микро­диссекции очень долог и во многом зависит от мастерства оператора. В настоящее время для точной и воспроизводимой микродиссекции всё чаще используют лазеры. В ряде приборов применён принцип лазерной микропучковой микродиссекции, когда точно сфокусирован­ным пучком ультрафиолетового лазера выреза­ют клетки или область, защищенную фотопиг­ментом, предотвращающим разрушение ДНК в УФ-свете. В других приборах используют прин­цип лазерного захвата. Этот принцип основан на селективном прилипании выбранных кле­ток или фрагментов ткани к термопластической мембране, активированной пульсами низко­энергетического инфракрасного лазера. Термопластическая мембрана, используемая для переноса выбранных клеток, имеет диаметр около 6 мм и располагается на дне оптически прозрачной крышки, которая закрывает 0,5 мл микроцентрифужную пробирку с раствором для экстракции ДНК или РНК. Морфология выре­занных клеток хорошо сохраняется и может быть документирована на всех стадиях проце­дуры. Поскольку микродиссекция с лазерным захватом не разрушает окружающие ткани, 2—3 участка, содержащие разнородные морфологи­ческие структуры (нормальные, пограничные и опухолевые клетки), могут быть взяты для ана­лиза с одного препарата. В настоящее время микродиссекция с лазерным захватом широко используется для анализа генетических изме­нений ДНК, определения потери гетерозиготности в инвазивных опухолях.

Таким образом, современный патолог обладает возможностью использовать значительный арсе­нал методов, начиная с рутинных и заканчивая молекулярно-биологическими, для диагности­ки цитологического и биопсийного материалов.

Выбор тех или иных методов обусловливается видом материала (мазок, криостатный или па­рафиновый срез), особенностями его фиксации, гистоархитектурными особенностями ткани и конечными целями исследования.