Взятие и доставка в лабораторию проб фекалий

Рукой в резиновой перчатке берут примерно 100 г фека­лий из прямой кишки животных или только что выделивших­ся при испражнении. В последнем случае берут пробу с верх­ней части экскрементов, не соприкасавшейся с полом или поч­вой. Руку и пинцет после взятия каждой пробы тщательно моют. Пробы от мелких животных берут с помощью груши. Вращательными движениями наконечник груши вводят в пря­мую кишку. При сдавливании груши воздух входит в кишку. Затем наконечник груши вынимают. Эта манипуляция вы­зывает рефлекторный акт дефекации. После каждого взятия пробы наконечник груши тщательно промывают. Взятый материал регистрируют в описи сопроводительного доку­мента.

Каждую пробу помещают в пакетик из плотной бумаги или целлофановый, нумеруют и отправляют в лабораторию с описью в сопроводительном документе. В нем указывают хозяйство, отделение или владельца животных, вид и количество их в стаде (отаре, табуне), дату взятия проб и цель исследо­вания.

В лабораторию отправляют пробы не более суточной дав­ности со времени их взятия. При исследовании на диктиокаулез и стронгилоидоз пробы следует доставлять в лабораторию не позже чем через 4 ч после взятия.

Если нет возможности своевременно доставить пробы в лабораторию, их можно консервировать, используя для этой цели физические и химические методы консервации.

Из физических методов наиболее распространенным и простым является воздействие низких температур. Пробы по­мещают в холодильник при температуре +2…-4°С, что задерживает развитие личинок.

Можно использовать и различные химические средства:

ü жидкость Барбагалло (3%-ный раствор формалина в изо­тоническом растворе натрия хлорида). В ней пробы фекалий могут сохраняться до двух недель;

ü смесь, состоящую из формалина (5 мл), глицерина (5 мл) и воды (100 мл);

ü смесь, состоящую из 0,2%-ного натрия азотнокислого (1900 мл), раствора Люголя (250 мл), формалина (300 мл) и глицерина (25 мл).

 

Гельминтоскопия

 

Для обнаружения гельминтов в фекалиях их смешивают с водой (1:10) и смеси дают отстояться. Через некоторое вре­мя (не менее 5 мин) верхний слой воды сливают, а к осадку приливают новую порцию воды. Так повторяют несколько раз, что позволяет удалить большую часть посторонних веществ, а в осадке остаются паразиты и нерастворимые тяжелые час­ти фекалий. Затем осадок исследуют макро- и микроскопи­чески.

Макроскопическое исследование. Промытый осадок фе­калий вновь разбавляют водой, небольшими порциями нали­вают в черную кювету и при медленном покачивании ее вни­мательно просматривают осадок. Можно брать осадок неболь­шими порциями, выливать в чашки Петри и просматривать под лупой или микроскопом. Некоторых гельминтов лучше просматривать на белом фоне. Поэтому рекомендуют одну половину кюветы окрашивать в черный цвет, другую – в бе­лый. Так последовательно просматривают весь материал. Обнаруженных паразитов выбирают препаровальной иглой или кисточкой и фиксируют.

Микроскопическое исследование. Для обнаружения мел­ких форм паразитов отмытый осадок исследуют в бактерио­логических чашках с помощью штативной лупы (6-10-крат­ное увеличение).

 

Гельминтоовоскопия

Оборудование и средства. Для проведения гельминтоовоскопии необходимо следующее оборудование и материалы: микроскоп биологический (МБИ) или микроскоп биологичес­кий стереоскопический (МБС), предметные и покровные стек­ла, бактериологические чашки, пинцеты, ножницы, стеклянные палочки, фарфоровые ступки и пестики, стаканчики из стекла или синтетического материала с верхним диаметром 4-5 см (мензурки в форме усеченного конуса на 50 мл), можно ис­пользовать баночки Флоринского, ситечки с металлической или покровной сеткой (кусочки чулочной ткани или марли) с ве­личиной сторон ячеек 0,25-0,3 мм, центрифужные пробирки, центрифуга до 2 тыс. об/мин, металлические петли с диамет­ром кольца 5-8 мм, спиртовая или газовая горелка, флотаци­онные растворы, десенсиметр для проверки плотности флота­ционных растворов, глицерин, молочная кислота, глазные пипетки, целлофановая пленка.

Приготовление флотационных растворов. Насыщенный раствор натрия хлорида (NaCl). В эмалированное ведро с кипящей водой порциями кладут соль, постоянно помешивая деревянной лопаточкой до полного ра­створения. Соль добавляют до тех пор, пока она не начинает выпадать в осадок. Для приготовления раствора требуется 420 г соли на 1 л воды. В горячем виде раствор фильтруют через марлю. При остывании раствора кристаллы хлорида натрия выпадают в осадок, что свидетельствует о плотности насыщенного раствора, равной 1,18-1,20.

Раствор свинца нитрата (азотнокис­лого свинца) (Pb(NO₃)₂). Соль растворяют в горячей воде порциями при подогревании и постоянном помешивании до полного растворения. На 1 л воды требуется 650 г соли. Фильтровать раствор не обязательно. Плотность насыщенно­го раствора 1,5. Он обладает высокой флотационной способностью. Однако уже через 24 ч после приготовления плот­ность несколько падает за счет выпадения частиц соли в оса­док. Поэтому перед употреблением раствор подогревают с размешиванием осадка. Плотность уточняют десенсиметром.

Нитрат свинца – соль тяжелого металла, при работе с ним следует соблюдать осторожность.

Раствор аммония нитрата (NH₄NО₃) готовят так же, как и предыдущий раствор. На 1 л воды расходуют 1500 г гранулированного порошка аммониевой селитры. Плот­ность раствора нитрата аммония должна быть 1,5.

Раствор натрия нитрата (NaNO₃) готовят путем добавления на 1 л воды 1 кг азотнокислого натрия. Плотность раствора равна 1,38-1,40.

Раствор цинка сульфата (ZnSO₄∙7H₂O) приготавливают при добавлении на 1 л воды 400 г сернокис­лого цинка. Его плотность равна 1,24.

Раствор натрия тиосульфата (Nа₂S₂О₃∙5Н₂О) с плотностью 1,4 готовят путем добавления к 1л воды 1750 г вещества.

Раствор магния сульфата (MgSO₄) с плотностью 1,26-1,28 готовят путем добавления 920 г соли yа 1 л воды.

 

Методы седиментации

Метод последовательных промываний применяют для ди­агностики трематодозов. Пробу фекалий (3-5 г) кладут в стаканчик или фарфоровую ступку, заливают небольшим ко­личеством воды и, размешивая стеклянной палочкой (в ступке пестиком), добавляют воду до 50-100 мл. Смесь фильтруют через ситечко или марлю (1 слой) и отстаивают 3-5 мин. Затем верхний слой сливают, а к осадку добавляют такое же количество воды и процедуру повторяют до тех пор, пока надосадочный слой не будет прозрачным. Верхний слой слива­ют, а осадок порциями разливают в чашки Петри или на пред­метное стекло и микроскопируют.

Модификация метода по Т.Г. Никулину. Учитывая, что при последовательном сливании надосадочной жидкости про­исходит взмучивание, осадок и часть яиц трематод могут быть слиты. Т.Г. Никулин предложил отсасывать надосадочную жидкость грушей. При массовых исследованиях на наконеч­ник груши надевают кружок из картона (ограничитель). По­скольку во всех пробах в стаканчиках остается одинаковое количество осадка и он не взмучивается, результаты исследо­ваний являются более достоверными.

Метод седиментации с целлофановыми пленками по Г.А. Котельникову и В.М. Хренову предложен для диагно­стики фасциолеза и дикроцелиоза жвачных, аскариоза и трихоцефалеза свиней. Из гидрофильного целлофана толщиной 22 мкм нарезают прямоугольные кусочки 2x3 см и помещают их на 24 ч в бактериологическую чашку с 50%-ным раство­ром молочной кислоты или глицерина на одни сутки.

После приготовления целлофановых пленок берут пробу фекалий массой 2 г и размешивают в стаканчике с небольшим количеством воды. Взвесь фильтруют через металлическое ситечко или марлю (1 слой) в чистый стакан емкостью 50 мл, отстаивают 15 мин, сливают надосадочную жидкость, а к осад­ку добавляют 35-40 мл водопроводной воды, опять отстаива­ют 5 мин, надосадочную жидкость сливают, осадок переносят на предметное стекло и покрывают целлофановой пленкой. Через 8-10 мин проводят микроскопию препарата. Раствор молочной кислоты или глицерина просветляет препарат, а плен­ка предохраняет его от высыхания.

Флотационно-седиментационный метод Н.В. Демидо­ва применяют для диагностики фасциолеза. Пробу фекалий (от крупного рогатого скота – 5 г, от овец – 3 г) помещают в большой стакан, заливают доверху насыщенным раствором натрия хлорида и тщательно размешивают стеклянной палоч­кой до получения равномерной взвеси. Взвесь отстаивают 15-20 мин, затем чайной ложечкой или совочком удаляют всплывшие па поверхность грубые частицы. Жидкость отсасывают грушей (при массовом исследовании допускается сливание), оставляя 20-30 мл ее над осадком, к осадку доливают воду до полного объема стакана и тщательно размешивают палоч­кой. Взвесь фильтруют в большие стаканы, фильтрат отстаи­вают в течение 5 мин (для фильтрации используют марлю или металлическое ситечко с ячейками 0,25 мм), жидкость из стаканов отсасывают, оставляя на дне 15-20 мл осадка. Оса­док перемешивают в конических стаканчиках, большие стака­ны прополаскивают водой и выливают, смыв в маленькие, взвесь отстаивают в конических стаканчиках 3-5 мин, а жидкость отсасывают. Эту процедуру повторяют до просветления надосадочной жидкости, затем осадок переносят на предметное стек­ло и микроскопируют.

 

Методы флотации

Метод Фюллеборна. В стакане емкостью 200 мл разме­шивают 8-10 г свежих фекалий с 20-кратным объемом насы­щенного раствора натрия хлорида. После тщательного разме­шивания смесь фильтруют через металлическое или капроно­вое ситечко (можно через марлю) в другой чистый стакан емкостью 100 мл и оставляют на 45-60 мин. Затем проволоч­ной петлей с поверхности взвеси берут 3-6 капель и наносят на хорошо обезжиренное предметное стекло, покрывают по­кровным стеклом и микроскопируют.

Метод Дарлинга. Пробу свежих фекалий массой 5 г сме­шивают в стакане с водой в соотношении 1:10 и через ситечко или марлю процеживают в другой чистый стакан. Фильтрат отстаивают 5 мин, верхний слой жидкости сливают, не взмучи­вая осадка, а осадок с небольшим количеством оставшейся жидкости (10 мл) переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют 2 мин при скорости 1500 об/мин. Надоса­дочную жидкость сливают, а к осадку приливают жидкость Дарлиига (глицерин, смешанный в равных частях с насыщен­ным раствором хлорида натрия). Пробирку встряхивают или размешивают палочкой, чтобы осадок смешался с флотацион­ной жидкостью, повторно центрифугируют в течение 2 мин при скорости 1500 об/мин. При наличии в пробе фекалий яиц гельминтов они всплывают на поверхность жидкости в центрифужной пробирке. Гельминтологической петлей берут 3-4 капли с поверхности взвеси, наносят на предметное стек­ло и микроскопируют.

Метод И.А. Щербовича выполняют по такой же методике, как и Дарлинга, но в качестве флотационной жидкости используют насыщенные растворы натрия гипосульфита или магния сульфата. Поскольку плотность указанных растворов выше, чем плотность жидкости Дарлинга, метод Щербовича используют для диагностики гельминтозов, яйца возбудителей которых имеют больший удельный вес (метастронгилез сви­ней, трихоцефалез, макраканторинхоз и др.).

Метод Г.А. Котельникова и В.М. Хренова наиболее эффективен при диагностике нематодозов, эймериозов и других паразитозов животных. Он выполняется в двух вари­антах.

Суть первого варианта состоит в том, что пробу фекалий массой 3 г кладут в стаканчик, добавляют раствор аммиачной селитры и тщательно размешивают стеклянной палочкой. За­тем порциями доливают раствор соли до 50 мл. Полученную взвесь фильтруют через металлическое или капроновое си­течко в другой стаканчик и дают отстояться в течение 10 мин. При диагностике стронгилятозов достаточно, чтобы взвесь от­стоялась в течение 3-5 мин. После этого гельминтологичес­кой петлей с поверхности взвеси снимают 3-6 капель с раз­ных мест, переносят их на предметное стекло и микроскопируют.

Второй вариант – метод флотации с аммиачной селитрой и с центрифугированием – это модификация метода Дарлинга при использовании в качестве флотационной жидкости на­сыщенного раствора аммиачной селитры. Он оказывается очень эффективным при диагностике ряда цестодозов, аскаридатозов, стронгилятозов и других паразитов.

Гельминтоларвоскопия

Оборудование и средства. Термостат, центрифуга, мик­роскоп биологический (МБИ) или микроскоп биологический стереоскопический (МБС), аппарат Бермана, чашки бактериологические, баночки Флоринского, часовые и предметные стекла, пипетки глазные, марля, вата, 0,1%-ный водный раствор метиленового синего, насыщенный раствор цинка сульфата, центрифужные пробирки, пинцеты, ножнички, топкая мягкая проволока, конические стаканчики, стеклянные палочки, ра­створ Люголя.

Метод Бермана. Пробы свежих фекалий (10 г) помещают завернутыми в марлю или на металлическую сетку в воронку аппарата Бермана. Предварительно резиновую труб­ку, присоединенную к воронке, закрывают зажимом и в ворон­ку заливают воду комнатной температуры (35-38°С). Фека­лии мелких жвачных оставляют в воронке на 4-6 ч, крупного рогатого скота и лошадей – на 10-12 ч. За это время личин­ки диктиокаулюсов выползают из пробы фекалий в воду и постепенно опускаются по трубке вниз к зажиму. По истече­нии указанного времени зажим открывают и жидкость из ниж­ней части трубки осторожно сливают в бактериологическую чашку и исследуют под микроскопом.

Метод Бермана-Орлова является модификацией метода Бермана. В аппарате Бермана на конец резиновой трубки за­жим не устанавливают, а плотно присоединяют пробирку. При помещении в воронку с теплой водой фекалий личинки гельминтов оседают на дно пробирки. По истечении необходимого срока (для мелкого рогатого скота – 4-6 ч, для крупного рогатого скота и лошадей – 10-12 ч) пробир­ку отсоединяют от резиновой трубки, жидкость аккуратно сли­вают или отсасывают пипеткой, а осадок помещают на пред­метное стекло или чашку Петри и микроскопируют.

Метод И.А. Щербовича. Пробу фе­калий (8-10 г) помещают на кусочек марли, концы которой закручивают тон­кой мягкой проволокой и подвешивают в стакан с водой температурой 35-38°С. Пробы фекалий мелких живот­ных и лошадей выдерживают в течение 3 ч, крупного рогатого скота – 12 ч. Затем пробу фекалий из стакана извлекают, воду осторожно (не взбол­тать) сливают, осадок помещают в центрифужную пробирку и центрифугируют в течение 1 мин со скоростью 1000 об/мин. Надосадочную жидкость в пробирке сливают, осадок перено­сят на предметное стекло и микроскопируют.

Метод Вайда. На предметное или часовое стекло кладут несколько шариков свежевыделенных фекалий овец или коз и добавляют небольшое количество воды температурой около 40°С. Если шарики помещают на предметное стекло, достаточно нескольких капель воды. Через 40 мин шарики удаля­ют, оставшуюся жидкость на стекле исследуют под микроско­пом па наличие личинок. Методика эффективна при условии, если фекалии плотные. Применяют для диагностики диктиокаулеза, мюллериоза, протостронгилеза, цистокаулеза овец и коз.

Флотация с раствором цинка сульфата – избиратель­ный экспресс-метод диагностики диктиокаулеза по Котельникову и Хренову. Пробы фекалий (по 5 г) овец и коз кладут в стаканчик с раствором цинка сульфата, в течение 1-2 мин энергично разгоняют по кругу, не растирая и не размешивая. Не менее чем через 5-10 мин пробы вынимают пинцетом, взвесь оставляют на 10-15 мин. Затем металлической пет­лей снимают 6 капель с поверхности жидкости, переносят на предметное стекло и микроскопируют.

Пробы от овец полужидкой консистенции и пробы от телят (5 г) также помещают в стаканчики с раствором цинка сульфата и выдерживают 20-30 мин без разгонки и размешива­ния. Затем фекалии удаляют, через несколько минут снимают металлической петлей 6 капель с поверхности пленки и мик­роскопируют. Личинки диктиокаулюсов в поверхностной плен­ке сохраняют подвижность до 3 ч. Метод обладает избира­тельностью в отношении личинок диктиокаулюсов. Личинки стронгилят пищеварительного тракта и стронгилоидов дефор­мируются и разрушаются в течение 1-2 мин, личинки мюллериусов свертываются спирально и напоминают пузырьки воз­духа.