Хранение и пересылка гельминтологического материала

Законсервированный и этикетированный материал хранят в плотно закупоренной посуде. Пробирки с гельминтами по­мещают в большую банку с притертой пробкой, наполненную консервирующей жидкостью. Пробирки можно ставить в не­сколько ярусов, перекладывая их слоем ваты. В таком виде гельминты сохраняются длительное время.

Пересылать гельминтологический материал можно в про­бирках или банках, хорошо упакованных в деревянные ящи­ки. Патологоанатомические препараты, фиксированные в 10%-ном растворе формалина, можно пересылать без жидкости. Орган, извлеченный из фиксирующей жидкости, заворачивают во влажную вату или марлю, помещают в целлофановый па­кет, а затем упаковывают в плотный ящик.

Методы выявления и исследования простейших

Пироплазмиды

Для выявления пироплазмид исследуют мазки крови от животных, больных или подозреваемых в заболевании. В слу­чае гибели или вынужденного убоя больных животных мазки можно готовить из содержимого сосудов мозга, селезенки, пе­чени, почек, легких и пораженных лимфатических узлов. Маз­ки готовят только из органов свежих трупов, так как в них паразиты быстро лизируются, особенно при высокой темпера­туре окружающей среды. В необходимых случаях принимают меры для исключения инфекционных болезней.

Используют хорошо обезжиренные стекла. Кровь для ис­следования лучше всего брать из периферических сосудов ушной раковины. Место взятия подготавливают путем выстригания волосяного покрова, затем проводят дезинфек­цию и обезжиривание этиловым спиртом, спиртом-эфи­ром. Инъекцию проводят иглой или подрезают ножницами кончик уха.

Каплю крови в диаметре не более 2-3 мм, выступающую на месте прокола, наносят на край обезжиренного предметно­го стекла и делают мазок. Очень важно мазок подготовить с первой капли крови, т.к. в ней значительно больше поражен­ных пироплазмидами эритроцитов. Следующий мазок необ­ходимо готовить из свежей капли крови после удаления сгус­тка с места инъекции.

Изготовление мазков необходимо проводить в период повышения температуры тела животных и появления первых клинических признаков, до введения специфических препара­тов. Мазки просушивают на воздухе 10-20 мин, избегая воз­действия прямых солнечных лучей и ограничивая доступ мух. Затем их подписывают иглой или простым карандашом, ука­зывая вид и номер животного, дату и место взятия.

Для фиксации используют метиловый спирт, которым за­ливают мазки крови на 3-5 мин, после этого стекла вынима­ют и высушивают 15-20 мин.

Можно фиксировать смесью равных частей абсолютного этилового спирта и эфира или только этиловым спиртом 15-20 мин.

Хорошо подготовленный мазок должен быть равномерным и тонким. В толстых мазках эритроциты и находящиеся в них паразиты обнаруживаются с большим трудом.

Окраску можно производить по Романовскому-Гимзе. Для приготовления рабочего раствора краски на 1 мл дистиллированной воды добавляют 1-3 капли основного раствора краски. Рабочий раствор лучше всего подслаивать под стекло с мазком. В этих случаях на мазке не остается микрочастиц нерастворившейся краски, что облегчает при мик­роскопии поиск кольцевидных форм пироплазмид и диффе­ренциальную диагностику. Длительность прокрашивания маз­ков составляет 30-40 мин. По истечении этого срока краску смывают, мазок промывают дистиллированной водой, высуши­вают и исследуют с использованием микроскопа. Качество окраски зависит от рН среды (оптимальной средой является 6,8-7,0). Правильно окрашенные мазки имеют розовый цвет с фиолетовым оттенком. Эритроциты окрашиваются в розо­вый цвет, протоплазма лимфоцитов – в синий, их ядра – в темно-фиолетовый, протоплазма паразитов – в голубой, ку­сочки хроматина – в темно-красный или красный цвет.

Исследуют мазки под микроскопом с иммерсионной сис­темой.

Диагностика эймериозов и изоспорозов

Для выявления наличия ооцист эймерий и изоспор из фекалий, содержимого кишечника и другого материала исполь­зуется несколько методов.

Метод нативного мазка наиболее простой и легко выпол­нимый в любых условиях, не требующий специальной аппара­туры и реактивов для обнаружения ооцист.

На чистое предметное стекло пипеткой наносят 2-4 кап­ли чистой воды (дистиллированной, водопроводной), к ним добавляют небольшое количество фекалий и перемешивают. Мазок накрывают покровным стеклом и исследуют под малым (х 8,10) и средним (х 40) объективом. Вместо фекалий можно исследовать таким же образом соскобы оболочек кишечника.

При небольшой степени заражения ооцист выявить таким методом трудно, однако при высоком заражении он дает возможность сравнительно достоверно определить интенсив­ность инвазии.

Более точные результаты получают при использовании различных растворов, имеющих большой удельный вес. В та­ких растворах ооцисты через некоторое время всплывают на поверхность.

Наиболее распространенными флотационными методами являются следующие: методы Фюллеборна, Дарлинга, Щербовича, Котельникова и Хренова и др. (см. Гельминтоовоскопия).

Исследование эймериид в пораженных органах. Для ис­следования на наличие эймериид у животных отбирают ку­сочки тонкого и толстого кишечника, у кроликов, кроме того, печень, у гусей также почки. Материал помещают в фиксиру­ющую жидкость – 10%-ный раствор формалина или 96%-ный этиловый спирт. Лучше всего использовать нейтральный формалин, для приготовления которого используют порошок углекислого кальция (мел), 10% его добавляют к объему фор­малина и дают отстояться 5-6 дней, затем хранят с осадком.

Фиксацию материала лучше производить в стекляннойпосу­де. В зимнее время в качестве фиксирующей жидкости лучше использовать этиловый спирт. Ее, независимо от времени года, рекомендуется через сутки заменять. Если в одну банку поме­щают кусочки органов от разных животных, их рекомендует­ся завернуть в марлевые мешочки. Внутрь банки с фиксиру­ющим материалом помещают бумажную этикетку, на которой графитным карандашом указывают вид животного, его номер и дату взятия материала.

Приготовленные гистологические срезы лучше всего окра­шивать гематоксилин-эозином.

При необходимости сохранения ооцист эймериид на дли­тельное время используют 5%-ный раствор формалина, 0,1%-ный раствор калия двухромовокислого, жидкость Барбагалло (3%-ный раствор формалина на изотоническом растворе натрия хло­рида).

Токсоплазмы

Для выделения токсоплазм используют органы павших животных: головной мозг, лимфатические узлы, печень, селезенку, легкие, плаценту и органы абортированного плода. Вначале готовят мазки-отпечатки из пораженных органов, которые фиксируют метиловым спир­том (этиловым) и окрашивают по Романовскому-Гимзе. Отбор органов и приготовление мазков производят не позже 2-3 часов после убоя или падежа животных. Указанным способом выделить токсоплазм удается не всегда.

Более эффективным способом является постановка биопробы на белых мышах.

Для этого отобранный материал из внутренних органов растира­ют с небольшим количеством изотонического раствора натрия хлорида и полученную суспензию вводят 3-5 белым мышам внутрибрюшинно по 0,5мл. В положительных случаях на 5-7 день развивается болезнь, при которой в брюшной полости накапливается экссудат, содержащий большое количество токсоплазм. При отрицательной биопробе, а также для накопления токсоплазм можно проводить 3-5 «слепых пассажей» путем введения суспензии головного мозга мышам от зараженных ранее белых мышей новой партии мышам.

Методическими указаниями по лабораторным исследованиям на токсоплазмоз животных, утвержденными 21.01.84, рекомендуется для обогащения материала цистами применять метод искусственного пере­варивания в желудочном соке. Патматериал (лимфоузлы, продолговатый мозг абортированного плода) измельчают, 50 г фарша помещают в колбу емкостью 1 литр и заливают 10 объемами искусственного желудочного сока. Колбу помещают в термостат при температуре 37°С на 1,5 часа. Полученную массу фильтруют через марлю, затем фильтрат центрифуги­руют при 2 тыс. об./мин. в течение 15 минут. После удаления надосадочной жидкости осадок ресуспензируют в двойном объеме изото­нического раствора с добавлением антибиотиков (пенициллин, стрептомицин по 1 тыс. ЕД на 1 л суспензии). Суспензию в дозе 0,3 мл вводят внутрибрюшинно 3-5 белым мышам.

Для обнаружения токсоплазм готовят мазки из содержимого брюшной полости или мазки-отпечатки из головного мозга, фиксируют, затем окрашивают по Романовскому-Гимзе.

Наличие возбудителя в организме животных может быть подтвер­ждено путем использования РСК (РДСК), которую ставят в соответствии с «Временным наставлением по применению токсоплазмозного антигена Каз.НИВИ и института зоологии АН Каз.ССР в реакции связывания комплемента РСК (РДСК) для серологической диагностики токсоплазмоза и токсоплазмоносительства у животных».

 

Саркоцисты

Для обнаружения саркоцист исследуют у овец шейную часть пищевода, скелетные мышцы. Находят макроцисты величиной с прося­ное зерно и больше.

У свиней их можно обнаружить в мышцах диафрагмы, межреберных и др. Саркоцисты освобождают от окружающей ткани, на предметном стекле разрушают в 2-3 каплях изотонического раствора нат­рия хлорида, затем каплю суспензии микроскопируют при среднем увеличении микроскопа с опущенным конденсором. В положительных случаях обнаруживают банановидные (серповидные) мерозоиты.

Обнаружение микроцист производят путем исследования срезов величиной с овсяное зерно с мышц пищевода, диафрагмы, сердца, скелета. Срезы исследуют в раздавленном в компрессории виде под малым уве­личением микроскопа. Их можно окрашивать по Романовскому-Гимзе, генцианвиолетом, метиленовой синью и др.

Саркоцистможно также обнаружить и при гистологическом исс­ледовании пораженных тканей. Отобранные кусочки ткани фиксируют в 10% растворе нейтрального формалина. Гистосрезы готовят обще­принятыми методами, а окрашивают гематоксилин-эозином.

 

Трихомонады

Выделение трихомонад производят путем микроскопического и культурального исследования патологического материала (истечения и смывыиз половых органов, околоплодная жидкость, соскобы с плаценты, содержимое сычуга абортированного плода, секрет придаточных половых желез, спермы).

Для обнаружения подвижных трихомонад наносят на предметное стекло патологический материал в виде толстого мазкаили делают раздавленную каплю и микроскопируют вначале под малым, затем сред­ним увеличением микроскопа при затененном поле зрения микроскопа. Мазок можно окрашивать по Романовскому-Гимзе с предварительной фиксацией в метиловом спирте.

Посевы исследуемого материала производят на специальные пита­тельные среды (среда Петровского) в количестве 0,3-0,5мл из осад­ка пробы. Материал помещают в термостат при 37⁰С и исследуют на 3, 5, 7 и 10 день. Уже через 24-46 часов может наблюдаться рост трихомонад.

Вышеуказанные методы используются для выделения трихомонад при поражении половых органов у крупного рогатого скота.

У свиней, птиц трихомонады обитают в кишечнике и некоторых других органах. Для выделения паразитов используют соскобы с пораженных органов и исследуют нативным мазком.

Имеются данные о том, что и эти трихомонады хорошо растут на искусственных питательных средах.

 

Балантидии

Выделение балантидий производят путем исследования свежевыделенных фекалий или взятых из прямой кишки животного. Материал необходимо подвергнуть исследованию не позднее 2-3 часов после его взятия. Трупы свиней на наличие балантидий исследуют в течение 5-6 часов после смерти животного. В более поздние сроки баланти­дий обнаружить не удается в связи с их лизисом. По некоторым дан­ным (А.И.Федоров, 1980) трупы следует подвергать исследованию на обнаружение балантидий в течение 1,5-2 часов после убоя или гибе­ли поросят.

Микроскопическое исследование фекалий лучше всего провести не­посредственно на ферме, используя метод нативного мазка. Для этого берут небольшое количество фекалий, помещают на предметное стекло и равномерно перемешивают с равным количеством теплого изотоничес­кого раствора натрия хлорида или дистиллированной воды (темпера­тура не более 37,0°С), накрывают покровным стеклом и просматрива­ют мазок под малым увеличением микроскопа. В положительных случа­ях обнаруживают вегетативные формы и цисты балантидий. Под микро­скопом отчетливо видны крупные, быстро передвигающиеся при помощи ресничек паразиты.

При необходимости гистологического исследования отбирают кусочки стенок толстого и тонкого кишечника, желудка, лимфоузлов, паренхиматозных органов и фиксируют в 10% растворе формалина. Гистосрезы окрашивают гематоксилин-эозином.