Питательные среды для культивирования гемофильных бактерий

Среды для выращивания гемофильных бактерий должны содержать специальные ростовые факторы. Для этого в основную среду крови добавляют свежий стерильный экстракт дрожжей или чистые препараты ростовых факторов: V-, Х-фактор.

Шоколадный агар. Содержит Х- и V-факторы. Агаровую питатель­ную среду (МПА, агар Хоттингера) расплавляют на водяной бане и, не охлаждая, добавляют в нее 10—15% по объему стерильной дефибринированной или нитратной крови лошади, барана или кролика. Пос­ле охлаждения питательной среды до 55—60°С содержимое сосуда тщательно перемешивают и разливают по чашкам или пробиркам.

Агар Левинталя. Содержит Х- и V-факторы. Готовят при изуче­нии морфологии колоний, так как шоколадный агар непрозрачен. В этом случае к расплавленной и затем охлажденной до 60°С агаровой среде добавляют, встряхивая, 10% стерильной дефибринированной или цитрированной крови барана или лошади. Кровь добавляют дробно (5—7 раз) при тщательном перемешивании питательной среды, флакон с которой в промежутках выдерживают на водяной бане с температурой 65°С. После внесения всего объема крови питательную среду нагревают до ки­пения и оставляют в кипящей воде в течение 5 минут. Затем среду выни­мают из водяной бани и 2-3 минуты выдерживают при комнатной темпе­ратуре. Процедуру прогрева среды повторяют три раза. Далее питатель­ную среду ставят на 2 ч на водяную баню при температуре 60°С для осаждения темных хлопьев свернувшейся крови. По истечении указан­ного срока осторожно, стараясь не взмучивать осадок, верхнюю прозрач­ную часть агара разливают по пробиркам или чашкам Петри.

Сывороточно-дрожжевой агар. Содержит V-фактор. К расплавлен­ному МПА или агару Хоттингера (рН 7,2-7,4) добавляют 5-10% сте­рильной сыворотки крови лошади, крупного рогатого скота, овцы, кролика и такое же количество дрожжевого экстракта.

Приготовление дрожжевого экстракта. 250 г прессованных пекарских дрожжей суспендируют до образования гомо­генной суспензии в 1 л дистиллированной воды. Суспензию в колбе из термостойкого стекла кипятят в течение 4—5 минут, непрерывно пере­мешивая. Микробную массу осаждают центрифугированием при 3-4 тыс. об/мин в течение 30 минут. Надосадочную жидкость сливают и сте­рилизуют, пропуская через стерилизующие пластины фильтра Зейтца. Полученный таким образом дрожжевой экстракт хранят в посуде из темного стекла при 4-5°С и используют в течение 8-10 суток после изготовления.

Среда с баккормилкой. Метод применяется для культивирования видов, рост которых зависит от наличия в среде V-фактора. Исследуе­мый материал (или изучаемую культуру) засевают газоном на сыворо­точной или кровяной МПА, можно на агар Хоттингера в чашки Петри. После этого по диаметру чашки крестообразно в виде непрерывной линии бактериологической петлей засевают «питающую» культуру бактерий. Чаще используют Е. coli или Staphylococcus albus, не облада­ющие гемолитическими свойствами. Эти виды бактерий в процессе роста выделяют V-фактор, который диффундирует в толщу агаровой среды. В зоне диффузии V-фактора, вблизи питающей культуры, так называемой «баккормилки», способны расти колонии гемофильных бактерий (сателлитный рост), нуждающиеся в V-факторе.

Среды с добавлением чистых препаратов Х- и V-факторов. Исполь­зуют препарат гемин (Х-фактор) и НАД (V-фактор). В питательную среду (плотную, жидкую) вносят растворы гемина, НАД или оба препарата, в зависимости от ростовых потребностей бактерий. При этом учитывают, что НАД термолаби­лен, его необходимо стерилизовать фильтрацией и добавлять в охлаж­денную до 45°С среду, а гемин термостабилен и выдерживает автоклавирование.

Среды с селективными свойствами используют для выделения гемофильных бактерий из загрязненного патологического материала.

Среда Controni с соавт. (1972). Предназначена для культивиро­вания Х- и V-фактор -зависимых видов бактерий. На чашке Петри с кровяным агаром (5% крови овцы) засевают по всей поверхности исследуемый материал. Затем на питательную среду помещают бумажный диск, пропи­танный раствором, содержащим 5% сапонина и 2 ЕД бацитрацина. Сапо­нин разрушает эритроциты, вокруг диска образуется зона гемолиза, и из крови, находящейся в агаре, освобождаются фактор Х и V-фактор, которые обеспечивают рост гемофильных бактерий. Бацитрацин подавля­ет рост бацилл.

Среда Chapin с соавт. (1983). Состоит из шоколадного агара, содер­жащего 5 мкг/мл ванкомицина, 300 мкг/мл бацитрацина и 1 мкг/мл клиндамицина. Данная среда неблагоприятна для различных видов бак­териальных контаминантов. Высеваемость гемофильных бактерий (Н. influenzae) в 10 раз выше, чем на обычном шоколадном агаре.

Среда Gilbride с соавт. (1983). Обладает ингибирующим действием на наиболее часто встречающиеся контаминанты (Е. coli, P. haemolytiса, Р. multocida, S. faecalis, S. aureus). Представляет собой триптозную среду с дрожжевым экстрактом, содержащую 1 мкг/мл кристаллвиолета, 1 мкг/мл линкомицина, 8 мкмг/мл спектиномицина, 128 мкг/мл бацитрацина.

Среда Pijoan с соавт. (1983). Рекомендуется использовать для подращивания Н. pleuropneumoniae перед высевом на плотную среду. Сос­тоит из сердечно-мозгового бульона с 5% лошадиной сыворотки, 5% дрожжевого экстракта, 100 мкг/мл ДПН, 0,5 мкг/мл линкомицина и 1,5 мкг/мл бацитрацина.

По данным Т. Little (1970), получены положительные результа­ты при выделении Н. pleuropneumoniae из контаминированного матери­ала на шоколадном МПА, содержащем 1:25 000 кристаллвиолета и 1,6 ЕД бацитрацина.

Микроорганизмы рода Campylobacter

Микроорганизмы, объедененные в данный род, включают 13 видов. Они известны с 1909 г, со времени выделения в Англии Мак Федиеном и Штокманом культуры C.fetus из эмбрионов при инфекционных абортах овец. Позднее, у КРС эту культуру выделили Смит и Тейлор (США, 1918). В СССР заболевание впервые диагносцировано у коров, в 1926 В. Якимовым. Морфологически это спиральные, S-oбpaзные или изогнутые в виде запятой, «крыла чайки» бактерии; размеры которых — 0,5-5,0 ´ 0,2-0,8 мкм, могут иметь один и более витков и достигать длины 8 мкм. При культивировании более 48-72 ч образуют кокковидные формы. Подвижные, обладают характерным «винтообразным движением», подвижность обусловлена наличием жгутика, расположенного на одном или двух полюсах (могут в 2-3 раза превышать длину клетки). Спор не образуют; хемоорганотрофы, у большинства видов метаболизм дыхательный. Углеводы не ферментируют и не окисляют, не образуют кислых и нейтральных конечных продук­тов метаболизма, энергию получают расщеплением аминокислот и интермедиатов цикла Кребса. Оксидазоположительны, редуцируют нитраты. Патогенные для человека виды капнофилы (необходимая концентрация СО₂ 10-15%) и микроаэрофилы (необходимая концентрация О₂ 3-15%) Некоторые могут также расти и в аэробных условиях (21% О₂), другие, например, С. fetus subsp. fetus, способны к росту в анаэробных условиях. Для роста в микроаэробных условиях некоторые виды нуждаются в ионах Н⁺ и формиатах. Некоторые виды растут в анаэробных условиях в присутствие фумарата, либо фумарата + формиата, формиата и Н⁺. Грамотрицательны, но водные и спиртовые растворы анилиновых красителей воспринимают с трудом, для идентификации их обычно окрашивают карболовым фуксином Циля (в разведении 1:5). Типовой вид — С. fetus. Род включает виды, патогенные да человека и теплокровных животных, вызывают поражения известные как кампилобактериозы. Обычно их выделяют из органов мочеполовой системы, кишечника и ротовой полости. Виды, патогенные для человека и вызываемые ими поражения, представлены в табл. 21, дифференциальные признаки — в табл. 22. Среди них наибольшее медицинское значение имеет С. jejuni, чья патогенность для человека, как возбудителя пищевой токсикоинфекции, была установлена сравнитель­но недавно (1972 г).

Группа Campylobocter jejuni (С. jejuni, С. coli, С. lari)

Культуральные свойства

Температурный оптимум 42°С; оптимум рН 7,0-7,2; для создания микроаэрофильных условий в анаэростате замещают 75% воздуха смесью из 90% азота и 10% СО₂ Оптимальную газовую среду получают с помощью коммерческих газогенераторных пакетов (например, Campy Pak II); удовлетворительный рост можно получить в анаэростате со свечой. В полевых условиях используют стерильные пластиковые пакеты, в которые вносят чашку, засеянную исследуемым материалом, и чашку, засеянную чистой культурой любого факультативного анаэроба (например, эшерихиями); последние будут поглощать О₂ и выделять СО₂ в процессе роста. Кампилобактерии плохо переносят транспортировку; при наличии опыта можно проводить непосредственную их идентификацию в образцах фекалий; в противном случае их следует помещать в консервант, например, тиогликолевый бульон (рН 8,5) или щелочную пептонную воду, содержащую 0,05% тиогликолята Na и 0,025% цистеина, и хранить при температуре 4°С. Для получения более чистых культур используют метод фильтрации через мембранные фильтры (диаметр пор 0,65 мкм), основное достоинство метода — возможность посева фильтрата на неселективные среды (например, КА или ША), основной недостаток — возможность больших потерь бактерий, но обычно ее не принимают во внимание, т.к. 1 г фекалий больного содержит 10⁷-10⁸ жизнеспособных кампилобактерий.

Таблица 21. Патогенные для человека кампилобактеры и вызываемые ими поражения

Вид	Природный резервуар	Поражения
С jejuni	ЖКТ диких и домашних животных или птиц	Гастроэнтериты
С. fetus подвид fetus	ЖКТ и мочеполовая система овец и крупного рогатого скота	Бактериемии, мертворождения;
С.fetus подвид venerealis	Мочеполовая система крупного рогатого скота	Иногда выделяют из испражнений гомосексуалистов и влагалища при вагинитах
С. hyointestinalis	ЖКТ свиней	Проктиты, диареи
С. coli	ЖКТ диких и домашних животных и птиц	Гастроэнтериты
С. lari	ЖКТ чаек	Диареи, бактериемии
С.cinaedi, С.fennelliae	?	Проктиты, проктоколиты, энтери­ты у гомосексуалистов
С. cryaerophila	ЖКТ и мочеполовая система овец и крупного рогатого скота	Диареи
С.concisus	Ротовая полость человека	Болезни периодонта
С.sputorum подвид sputorum	Ротовая полость человека	Диареи, кожные поражения
С.sputorum подвид bubulus	Мочеполовая система крупного рогатого скота	?
С.sputorum подвид faecalis	Мочеполовая система крупного рогатого скота	?

Для более быстрого выделения производят посев на селективные среды, например, среды Скирроу, Бутцлера или Престона. На твердых средах образуют колонии двух типов — плоские, влажные, прозрачные с мелкой грануляцией, слизистые, сероватые, «расползающиеся» колонии с неровными краями (могут быть очень мелкими и напоминать капли конденсата) либо мелкие дискретные блестящие выпук­лые колонии размером до 1-2 мм, ровными краями. На полужидких и жидких средах образуют поверхностную голубовато-серую пленку.

Биохимические свойства. Инертны к углеводам; кислых или ней­тральных конечных продуктов не образуют; большинство видов редуцирует нитраты; образуют H₂S; молоко не свертывают; не проявляют гемолитическую активность. Для роста не требуют сыворотки, энергию получают от аминокислот или промежуточных продуктов цикла Кребса, реакции Фогеса-Проскауэра и с метиловым красным отрицательные; желатину и мочевину не гидролизуют; оксидазоположительны; липазная активность отсутствует, пигментов не образуют.

 

Таблица 22. Дифференциально-диагностические признаки патогенных для человека бактерий рода Campylobacter

Вид	Рост при	Гидролиз гиппурата	Каталаза	Образование H2S	Восстановление нитратов	Чувствительность к
25°С	42°С	цефалотииу	налидиксовой кислоте
С. cinaedi*	–	±	–	+	–	+	+	+
С. сoli	–	+	–	+	±	+	–	+
С. сoncisus	–	+	–	–	+	+	–	–
С. сryaerophila	+	–	–	+	–	+	–	+
C.fennelliae ^*	–	–	–	+	–	–	+	+
С. fetus подвид fetus	+	±	–	+	–	–	+^**	–
С. hyointestinalis	±	+	–	+	+	+	+	–
С. jejuni	–	+	+^***	+	–	+	–	+^***
С. lari	–	+	–	±	+	+	+	–
С. sputorum	–	+	–	±	–	+	+	+

^* С. cinaedi и C.fennelliae напоминают Helicobacter pylori и, очевидно, скоро будут перенесены в род Helicobacter.

^** В настоящее время выделены штаммы С. fetus подвид fetus, резистентные к цефалотину.

^*** В настоящее время выделены гиппурат-отрицательные и резистентные к налидиксовой кислоте штаммы С. jejuni.

 

 

 

Для дифференцирования Campylobacter jejuni и С. coli, вызывающих абсолютно идентичные поражения, применяют экспресс-тест с гиппуратом (свежевыделенные штаммы С. jejuni всегда дают положительный результат).

Для дифференцирования Campylobacter jejuni и С. laridis можно использовать тест чувствительности к налидиксовой кислоте (первый вид чувствительный, второй — резистентный).

Антигенная структура

Важнейшие поверхностные Аг представлены ЛПС (О-Аг) и кислоторастворимыми белковыми фракциями, играющими ведущую роль в серотипировании. Общий Аг энтеробактерий отсутствует. Идентифицирован жгутиковый (Н-) Аг. По термостабильному, соматическому О –Аг, штаммы подразделяются на 60 сероваров, по термолабильному, поверхностному на 50 сероваров.

О-Аг определяют иммунологическую специфичность кампилобактеров, выявляемую в РНГА; они представлены низкомолекулярными веществами, а антигенные различия между разными сероварами обусловлены варьированием углеводного состава внутреннего ЛПС.

Белковый жгутиковый Аг, общий для всех сероваров.

Патогенез

Патогенез заболеваний обусловлен высокой адгезивной и инвазивной активностью кампилобактерий. Последние размножаются в присутствии желчи и быстро колонизируют верх­ние отделы тонкой кишки.

Прикрепление бактерий к слизистой оболочке во многом обеспечивают поверхностные специфические адгезины; большое значение имеет способность бактерии проникать через слизь и перемещаться вдоль эпителия (жизнеспособность в слизи coxраняют более 30 минут), т.е. жгутики — также важный фактор адгезии.

Данные микроорганизмы легко проникают через мембрану эпителиальных клеток и межклеточные ходы, например, после внесения бактерий в культуру клеток HeLa и часовой инкуба­ции практически во всех клетках обнаруживают бактерии. Клинический признак, подтверждающий их инвазивность, — наличие крови и слизи в испражнениях больных.

Колонизация кампилобактериями тонкой кишки приводит к развитию воспалительных изменений и отека слизистой оболочки; в lamina propria обнаруживают инфильтрат, содержащий полиморфноядерные лейкоциты, лимфоциты и плазматические клетки. Эндоскопия выявляет отек и гиперплазию слизистой оболочки, эрозии, сливающиеся в крупна изъязвления (в тонкой и толстой кишках).

Определенный вклад в патогенез поражений вносят термолабильный и термостабильный энтеротоксины.

По механизму действия термолабильный энтеротоксин напоминает термолабильные диареегенные токсины эшерихий и холерного вибриона (повышает уровень внутриклеточного цАМФ).

Термостабильный энтеротоксин (эндотоксин) высвобождается после гибели кампилобактерий; проявляет все свойства эндотоксинов грамотрицательных бактерий. Вызывает гибель мышей после введения живых или убитых микроорганизмов.

Характер и выраженность поражений определяют факторы макроорганизма и, в первую очередь, состояние иммунной системы. Группу повышенного риска составляют дети (особенно до 2 лет), пожилые, страдающие сопутствующими заболеваниями, пациенты с иммунодефицитами либо получающие стероиды и цитостатики.

Лабораторная диагностика

Основана на выделении возбудителя из испражений; следует помнить, что на характер колоний возбудителя влияет качество среды – на «свежих» средах колонии более склонны расползаться. При посеве фекалий от больных на селективные среды рост возбудителя отмечают на 3 и 4 квадрантах, но следует тщательно осматривать всю чашку, т.к. они могут вырасти на 1 квадранте в окружении колонии контаминирующей микрофлоры.

Для быстрой идентификации можно провести микроскопическое исследование фекалий; кампилобактеры видны как нежные грамотрицательные спиралевидные или S-образные бактерии (особенно часто типичные формы наблюдают при окраске кристаллическим фиолетовым). Также можно применять фазово-контрастную микроскопию суспензии испражнений в жидкой среде (например, в среде для культивирования бруцелл или Мюллера-Хинтона).

Для идентификации кампилобактериозов также могут быть использованы серологические методы, например РА (на 2 нед. титр AT составляет 1:8-1:32) или РСК (видоспецифическая реакция, требующая соответствующего Аг). В РФ разработаны экспериментальные партии диагностикумов для выявления AT в реакции РНГА.

Распространенность

Кампилобактериальные гастроэнтериты выявляют повсеместно; однако получению более полной картины препятствует несовершенство методов диагностики.

Заболеваемость может носить спорадический, преимущественно автохтонный характер (у городского населения - чаще при выездах в сельскую местность), особенно при слабой или умеренно выраженной диарее. Характерная особенность — сезонность заболевания (подъем заболеваемости в сельской местности наблюдают в зимние месяцы, а у горожан пик заболеваемости приходится на теплый сезон). Однако во многих случаях она может быть связана с выездом в другие страны («диарея путешественников»). Отмечены эпидемические вспышки различного происхождения (пищевые, водные, молочные).

Резервуар. Источники инфекции — животные (в том числе домашний скот и птица), от которых возбудители могут попадать в организм человека при употреблении сильно обсе­мененных продуктов. Важная роль принадлежит диким водоплавающим птицам, способным загрязнять источники водопользования. В ряде случаев резервуаром может быть больной человек, но процент носителей обычно бывает очень низким (менее 1% в попу­ляции) и, учитывая относительно низкую вирулентность возбудителей, его можно не принимать во внимание.

С. fetus подвид fetus

Впервые выделен в 1909 г. при инфекционных абортах; у человека (от беременных женщин, госпитализированных по поводу лихорадки неясного генеза) возбудитель выделил Венсан (1947). У части пациенток инфицирование приводило к выкидышам. Из крови ребенка, родившегося у одной из пациенток, был выделен микроорганизм, позднее идентифици­рованный как С. fetus подвид fetus и его посчитали причиной абортов. В настоящее время известно много случаев, зарегистрированных в США, Германии, Франции, Южной, Африке и Непале. Однако, механизмы инфицирования остаются плохо изученными; доказана возможность заражения при контактах с животными, при употреблении загрязненных воды и пищи; но в 30% случаев подобные факторы исключены и, предположительно, инфекция происходит из эндогенного источника. Клиническая картина поражений вариабельна: пиогенные менингиты и шингоэнцефалиты, аборты, эндокардиты, тромбофлебиты, артриты и желтуха с гепатомегалией. Установление точного диагноза возможно лишь при выделении возбудителя (чаще из крови, реже из гнойного отделяемого). Поскольку более 75% поражений приходится на возраст старше 45 лет, то можно полагать, что важную роль в развитии заболеваний играет состояние организма и наличие сопутствующих заболеваний (например, сахарный диабет, почечная или печеночная недостаточность, дефекты кроветворения), а сам возбудитель следует рассматривать как условно-патогенный. Иногда микроорганизм колонизирует ротовую полость; стоматологические манипуляции могут вызвать бактериемию. Выделение возбудителя проводят способами, рассмотренными выше; культуральные характеристики аналогичны таковым у прочих кампилобактеров.

С. coli

На плотных средах образуют округлые, выпуклые, глад­кие, блестящие колонии диаметром 1-2 мм. На кровяном агаре не дают гемолиза. При посеве уколом на полужидких средах растут бли­же к поверхности среды. Рост на среде с 8%-ной глюкозой и резистентность к бриллиантовой зелени, способность гидролизовать гиппураты являются дифференцирующими признаками от С.jejuni.

С. sputorum sb. mucosalis

Изогнутые, короткие клетки длиной 1,0-2,8 мкм, В старых культурах преобладают клетки кокковидной или нитчатой формы. Для развития микроба необходимы в атмосфе­ре микроаэрофильные условия, обеспечиваемые газовой смесью (5% О₂, 10% СО₂ и 85% Н₂) или анаэробные (Н₂).

На агаре образуют грязно-желтого цвета, приподнятые, с плоской поверхностью колонии диаметром до 1,5 мм. Растут на средах, содер­жащих 0,5% дезоксихолата натрия, бриллиантовый зеленый (1:100 000), 6% желчи. Не обладают уреазной активностью. Не гидролизуют жела­тин. Не образуют индол. Известно три серологических варианта: А, В и С.

Патогенны для свиней. Выделяются из слизистой кишечника с явле­ниями аденоматоза, некротического энтерита, локального илеита и пролиферативной геморрагической энтеропатии. Кроме того, могут быть выделены из ротовой полости у свиней.

Spirillum pulli

Вид с неустановленным систематическим положе­нием. Представляют собой ригидные спиралевидные клетки диаметром 1 мкм, длиной 5-12 мкм. Подвижны, имеют на концах по одному жгутику. Предположительно вызывают у цыплят месячного возраста заболевание, сходное с дифтероидным стоматитом. Возможность куль­тивирования на искусственных питательных средах не установлена.