Дифференциально- диагностическая среда Серова

Глюкоза 0,5 г

Мочевина 0,25 г

Молибденовокислый аммоний 0,1 г

Сода безводная 0,1 г

30% водный раствор сухой желчи 2,0 мл

1,6% водный раствор конго-рот 0,8 мл

1% водный раствор генцианвиолета 0,1 мл

Сухой агар 3,5 г

Дистиллированная вода 100,0 мл

Конго-рот и генцианвиолет растворить в горячей дистиллированной воде. Раствор сухой желчи готовить в стерильной воде.

Указанные ингредиенты вносить в дистиллированную воду, нагревать и кипятить 5 минут при помешивании, разлить в чашки Петри. Цвет среды темно-вишневый, pH — 7,2-7,4. Среду можно хранить в течение недели в холодильнике.

Среда с индикатором бромтимоловым синим (БТС)

Желчь медицинская 20 мл

Раствор NaOH 4% 10-12 капель

Сухой питательный агар 35 г

Глюкоза 10 г

Мочевина 5 г

1,6% спиртовой раствор с индикатором
бромтимоловым синим 8 мл

Дистиллированная вода 1 л

К 1 л воды добавить сухой питательный агар, медицинскую желчь и автоклавировать 20 минут при 0,5 атм. После охлаждения до 80°С добавить глюкозу, мочевину, индикатор бромтимоловый синий, смешать и сразу разлить в стерильные чашки Петри, pH – 7,8. Хранить среду при температуре 5-8°С в течение недели.

Универсальный скошенный столбик

Агар сухой питательный 3,5 г

Лактоза 0,4 г

Глюкоза 0,08 г

Крахмал растворимый 0,05 г

Сахароза 1,5 г

Мочевина 0,25 г

Уксуснокислый свинец 0,3-0,04 г

Тиосульфат натрия 0,03 г

Цистин 0,003 г

1% феноловокрасный
водорастворимый 2,5 мл

Дистиллированная вода 100 мл

Ингредиенты вносить в любом порядке. Количество питательного агара, вносимого в среду, зависит от его серии. Если на этикетке указано, что на 100 мл воды его надо брать 5 г, то в среду добавляют 3,5 г, если на этикетке имеется рекомендация 3,5 г на 100 мл, то добавляют 2,5 г. Среду кипятить в течение 10-15 минут, разливать в стерильные пробирки по 5 мл, автоклавировать при 0,5 атм. 15 минут, после чего скашивать. Цвет среды абрикосовый.

Щелочной раствор

Раствор А – калия гидроокись 400 г; вода дистиллированная до 1 л. Раствор В – натрия хлорид 5,0 г; вода дистиллированная до 1 л. Оба раствора приготовить отдельно и хранить в условиях холодильника. Перед началом работы приготовить рабочий раствор, смешивая 9,7 мл раствора В и 0,13 мл раствора А. Щелочной раствор должен быть прозрачным.

Среда Кларка для аутоагглютинации

Двузамещенный фосфат калия 5,0 г

Пептон 7,0 г

Глюкоза 5,0 г

Вода до 1 л

Пептон и фосфат калия растворить в воде и кипятить 2-5 минут. После удаления осадка среду стерилизовать при 120°С в течение 20 минут, асептично добавить стерильный раствор глюкозы и разлить по 3-4 мл в пробирки.

Микроорганизмы рода Pasteurella

Pasteurella — род паразитических бактерий, вызывающих поражения у млекопитающих и птиц. Пастереллезы (геморрагическая септицемия) - инфекционная болезнь многих видов сельскохозяйственных животных, птиц и людей. Она характеризуется явлениями септицемии и воспалительно-геморрагическими процессами во внутренних органах, на серозных и слизистых оболочках. Родовое название, по предложению Trevisan дано в честь Луи Пастера, установившего их патогенность. Микроорганизмы впервые были обнаружены при холере кур (Perroncito, Semmer, 1878). Выде­лены и обстоятельно изучены Pasteur (1880). Позднее данный возбу­дитель был выделен при септицемии кроликов (Gaffks, 1881), Боллингеревской повальной болезни диких животных (Kitt, 1883), сеп­тицемии свиней (Loeffler, 1886), септической плевропневмонии те­лят (Poels, 1886), повальной болезни буйволов (Orste, Armanni. 1887), септицемии овец (Galtier, 1889). P.multocida выде­лена из пищеварительного или респираторного тракта домашних ко­шек, собак, мышей, крыс, кроликов, северных оленей, лошадей, обезьян, львов, пантер, волков, опоссумов.

Под названием Pasteurella multocida в 1939 г. Rosenbush, Merchant объединили возбудителей куриной холеры и септицемии КРС. Тем самым они узаконили точку зрения Kitt (1885) и Hueppe (1886) о родстве этих микроорганизмов. Микроорганизмы данного рода объединены в 14 видов и представлены короткими овоидными палочками. Неподвижны, не об­разуют эндоспор; при окраске по Романовскому-Гимзе или метиленовым синим дают бипо­лярное окрашивание (особенно в препаратах из живых инфицированных тканей); в мазках расположены одиночно, реже — парами или короткими цепочками. Хемоорганотрофы; луч­ше растут на средах, содержащих кровь; метаболизм бродильный; углеводы ферментируют с образованием кислоты; восстанавливают нитраты. Каталазоположительны, почти всегда оксидазоположительны, желатиназо­отрицательны; реакции с метиленовым красным и Фогеса-Проскауэра отрицательны. Аэробы (факультативные анаэробы); температурный оптимум 37°С. Род включает много видов, основные из которых — Р.multocida с подвидами (multocida, septica и gallicida), P. dagmatis, P. gallinarum, P. canis, P. stomatis, P. anatis, P. langaa, P. avium, Р. aerogenes, P. haemolytica, P. pneumotropica и Р. volantium. Типовой вид — Р. multocida. Си­стематику рода нельзя считать законченной; на основании изучения ДНК-гомологии Р. aerogenes, Р. haemolytica, Р. urеае и Р. pneumotropica оказались близки к бактериям рода Actinobacillus и частично включены в его состав (Р.urеае). Дифференциальные признаки некоторых видов рода Pasleurella даны в табл. 17. Часто входят в состав микрофлоры дыхательных путей и глотки многих животных и птиц. При неблагоприятных условиях (обычно на фоне стресса) Р. multocida спо­собна вызывать пневмонии и сепсис у животных (заболевания известны как транспортная лихо­радка и куриная холера, гемморагическая септицемия). P. haemolytica – возбудитель септицемии ягнят и пневмонии КРС и овец. Заболевания человека до настоящего времени слабо изучены.

Морфология и культуральные свойства

Пастереллы — мелкие грамотрицательные коккобациллы (0,3-1,4´0,25-0,4 мкм); у Р. multocida, P.haemolytica и иногда у Р.pneumotropica выявляют капсулу. На этапах выделения предпочтительно использовать кровяные или сыворо­точные среды; вторичные генерации хорошо растут на обычных бактериологических средах. На твердых средах образуют мелкие, серые, иризирующие (радужные) при боковом освещении колонии (на момент выделения обычно S-формы); на жидких дают гомогенное помутнение и иногда осадок (на пептонной воде растут плохо).

Распространение

Первый случай выделения пастерелл у человека был описан в 1913 г. P. Brugnatelli, который выделил бактерию, похожую на P. multocida. Однако современные бактериологи не относят данный микроорганизм к указанному роду, т.к. возбудитель был подвижен и устойчив к желчи.

Таблица 17. Дифференциальные признаки основных патогенных для человека видов Pasteurella

Признаки	Р. multocida	Р.pneumotropica	Р.haemolytica
multocida	septica	gallicida
Оксидаза	+	+	+	+	+
b-Галактозидаза (тест с ONPG)*	–	–	–	+	±
Индол	+	±	+	+	–
Уреаза	–	–	–	+	–
Образование H2S	+	+	+	+	±
Орнитиндекарбоксилаза	+	±	+	±	±
Ферментация
- сорбита	–	+	+	–	+
- маннита	+	±	+	–	±
- трегалозы	+	±	–	+	±
- ксилозы	+	±	+	±	+
- лактозы	–	–	–	±	±
Гемолиз**	–	–	–	–	+
Рост на агаре МакКонки	±	±	±	–	+

* ONPG — o-нитрофенил-b-D-галактопиранозид

** На агаре с овечьей кровью

В 1930 году Karel и Ноlm описали болезнь человека, вызван­ную P. multocida – в результате укуса кошки. С тех пор в мировой медицин­ской практике данная инфекция регистрируется постоянно во все возрастающем количеств. Не вызывает сомнения, что источником бо­лезни человека являются животные. Пути передачи инфекции доста­точно разнообразны и, в первую очередь, через раны, полученные от животных. Черкасский Б.Д (1983) считает возможным трансмиссивный путь передачи возбудителя. Лебедев с соавт. (1971) сообщил о заболевании пастерел­лезом, вызванном алиментарным путем, связан­ным с обсеменением грызунами пищевых продуктов. Случаи передачи инфекции от человека к человеку не описаны. В связи с тем, что заболевание передается от животных, оно носит профессиональный характер.

Smith J.E. (1959) выделил P.multocida у 2-х из 71 студентов ветери­нарного колледжа, Jones J. (1973) получил ее от 2-х из 100 обследованных фермеров.Ранения и укусы животных – одна из основных причин распространения пастереллеза среди людей. По дан­ным органов здравоохранения США, в этой стране ежегодно происхо­дит регистрация 0,5-1,0 млн. людей,укушенных животными. Эта цифра соответствует примерно 1% от их общего реального количества. Укусы собак составляет 75-94% от всех укусов животных, укусы ко­шек 8-15% (Douglas, 1975; Scacellа,1969). Учитывая, что у 50-66% собак и 70-90% кошек являющихся клинически здоровы­ми, выделяют P.multocida из оральных и носовых истечении (Bailie et al., 1978; Owen et. al., 1968; Sathir, Carter, 1976; Smith, 1958) то надо признать, что степень инфицированности людей данные возбудителем достигает больших цифр.

Пастереллоносительство зарегистрировано у таких распростра­ненных животных, как свиньи – до 51% (Smith, 1958) и крысы – 14% (Schlpper, 1947). В неблагополучных птицеводческих хо­зяйствах оно достигает 95%. среди кроликов до 75% поголовья (Чер­касский, 1983).

По данным Olsen A.M. et al. (1952), P.multocida. при благоприятных условиях остается жизнеспособной в воде до 25 дней, в почве – 21 день. В трупах птиц микроорганизм сохраняется до 2-х месяцев. Е.В. Кожевников (1975) указывает, что в замороженном трупе птицы возбудитель сохраняется годами. Hubbert W.T., Rosen M.N. (1970) сообщают о сезонности в возникновении болезни. По данным авторов, максимум случаев пастереллеза животных приходится на июль-сен­тябрь и январь-март месяцы (до 34 и 27% соответственно). Столь широкое распространение возбудителя создает возможность высокого процента перезаражения людей.

Данный микроорганизм вызывает разнообразную клиническую кар­тину болезни человека. Ниже приведены различные формы течения пастерелпезной инфекции, которые сформированы в три группы (информа­ция приводится по данным Arons etal., 1982; Atin., Beethan, 1957; BezJak, Mlimica, 1979; Bouce, 1979; Ewing et al., 1980; Freigang, Elliot, 1963; Furie et al., 1980).

К первой группе клинической картины пастереллеза относятся раневые инфекции, вызванные P.multocida. Они обычно характеризуются быс­трым развитием и сильной воспалительной реакцией. По данным вы­шеуказанного автора, у 60% больных симптомы появляются в течение 24-48 часов и характеризуются наличием местной эритемы, опуха­нием, болезненностью. Возможно гнойное выделение. Болезнь может сопровождаться лихорадкой, головными болями, сонливостью (Томеску и др., 1982). Самыми частыми осложнениями бывает образова­ние абсцессов. Возможны и септический артрит вблизи места укуса, остеомиелит, возникающий в результате инокуляции. Часто встречается комбинация двух этих форм на пальце или руке после укуса.

Иногда P.multocida выделяют в комплексе с другими микроорганизмами, характерными для пролежней или стаза (Coodman, 1960; Holloway, 1965; Hubbert, 1970).

Ко второй группе относятся болезни, связанные с респиратор­ной и оральной системами. Необходимо отметить, что респираторный тракт является вторым по обширности источником выделения P.multocida после ран от укусов животных. Обнаруженные в органах дыхательной системы у больных, страдаю­щих легочными болезнями, пастереллы чаще всего являются P.multocida. Однако не исключена возможность серьез­ного заболевания респираторного тракта, при которых данный возбу­дитель является этиологическим агентом. Это относится, в первую очередь, к наиболее часто встречаемым бронхиту и пневмонии (Ewan, 1955; Hollowav et al., 1965; Mulder, 1938; Ilsen et al., 1952; Beyt et al., 1979; Calverly et al., 1981; Ellis, 1967; Freigang et al., 1963 и др.).

К данной группе относятся: отит (Ноllоwау et al., 1965), тонзиллит (Hubbaert et al., 1970), эпиема (Bailie, 1957; Bridie, 1960; Nelson, 1981).

Для бронхита пастереллезной этиологии характерно образование колоний на бронхиальном дереве больного. Наиболее предраспо­лагающим состоянием является расширение бронхов (Саwsоn et al., 1955: Ete Boer et al.. 1963: Morris et al., 1952 и др.), известны случаи, когда P.multocida в качестве сапрофита находи­лась в организме больных до 14 лет (Beyt et al. 1976; Cawson et al., 1955 и т.д.).

При пневмонии, вызванной P.multocida, симптомы характерны для этой болезни различной этиологии.

К третьей группе относятся оставшиеся системные заболевания, при которых данный микроорганизм является патогенным агентом. Сюда входят: менингит, абсцессы мозга, бактеримия, бактериальный перитонит, внутрибрюшинный абсцесс.

Таким образом, пастереллезная инфекция представляет значи­тельную угрозу для здоровья людей. Приведенные фак­ты связанны с возбудителем Р. multocida. Однако все выше сказанное не исключает наличия в качестве этиологического агента представителей других видов рода Pasteurella. Об этом свидетельствуют появившиеся сообщения. Yagupsku P. et аl. (1985) выделил из спинномозговой жидкости и крови пациента, страдающего гнойным менингитом, P.ureae. Авторы пришли к выводу, что указанный микроорганизм способен вызвать генерализованную инфек­цию у больных алкоголизмом и истощенных лиц. Gadberrv J.L. et al. (1984) впервые описал случай костной и суставной инфекции челове­ка, обусловленной P.pneumotropica.

В связи с этими данными возникают дополнительные проблемы, связанные с разработкой методов быстрой идентификации пастерелл различных видов. Вполне вероятно, что сложность их диагностики не позволяет расширить описываемую картину пастереллезной инфекции. Во всех случаях диагностика пастереллеза достаточно сложная. Она основана только на выделении чистой культуры и идентификации ее по бактериологическимтестам.

Weder D., Wolfson J. отмечают, что при первичной микроско­пии пастереллезную папочку обнаруживают в мазках спинномозговой жидкости в 80% случаев, в суставной жидкости в 50% случаев, в плевральной жидкости больных в 20% случаев. При использовании ком­мерческих систем тестирования API Mistek, Oci/Ferm идентифициро­вали только 68%, 11% и 81% тестированных изолятов соответственно.

К настоящему времени становится ясно, что пастереллы следует включить в ряд бактерий, являющихся возможными этиологичес­кими агентами тяжелых инфекционных болезней.

По классификации экспертов ВОЗ пастреллезы относятся к III и IV (из 7) группам повышенного риска, Данные группы определяют круг лиц, у которых больше всего шансов заболеть указанной инфек­цией. К группе III (полевые работники) относятся люди, работаю­щие на природе с дикими животными: лесники, охотники,рыбаки, на­туралисты, экологи-ис­следова­тели, топографы, геологи, строительные рабочие (дамбы, шоссе, трубопро­воды), а также туристы.

В группу IV (группа «досуга») включают лиц, имеющих контакт с комнатными или дикими животными в городских условиях: продавцы, владельцыживотных и члены их семей и гости, а также работники зоопарков, заповедников, заказников и их посетители, ветеринары.

Патогенез

Фактором патогенности можно считать капсулу бактерий, защищающую их от действия микробицидного потенциала фагоцитов. Как фактор вирулентности рассматривают способность пастерелл связывать и утилизировать ионы Fe²⁺.

Лабораторная диагностика

Основана на выделении и индикации возбудителя. В мазках из клинического материала выявляют грамотрицательные мелкие палочки, часто окрашивающи­еся биполярно.

Хорошо растут на КА; колонии 1-2 мм в диаметре; большинство видов не проявляет гемолитической активности, но может вызвать окрашивание среды в зеленый или коричневый цвет. Колонии отличаются затхлым запахом плесени.