Питательные среды для культивирования патогенных микобактерий

Среда Петраньяни. В стерильную колбу со стеклянными шарика­ми вносят 250 мл свежего цельного молока, 6 г картофельной му­ки, 1 г пептона, одну мелко нарезанную картофелину размером с ку­риное яйцо. Помешивая, выдерживают колбу с содержимым в кипя­щей водяной бане 10 минут, охлаждают до 60°С и вносят один желток и содержимое 4 свежих куриных яиц, 12 мл стерильного глицерина, 6 мл 2%-ного (на дистиллированной воде) раствора малахитового зеленого. Компоненты перемешивают, фильтруют через двойной слои марли, разливают по стерильным пробиркам и свертывают в наклон­ном положении в аппарате Коха при 85°С 30 минут. В последующие двое суток прогревают при 75°С по 15 минут. Готовая среда светло-зеленого цвета. Хранят на холоде.

Среда Левенштейна-Иеисена. Готовят солевой раствор следую­щего состава. В 600 мл дистиллированной воды растворяют перво­начально 2,4 г одноосновного фосфата калия, далее последователь­но 0,24 г сульфата магнезии, 0,6 г цитрата магнезии, 3,6 г L-аспарагина, 12 г химически чистого глицерина. Раствор стерилизуют текучим паром 120 минут, добавляют 30 г картофельного крахмала, разливают в колбы по 150 мл и нагревают в кипящей водяной бане до загустения смеси.

Затем готовят яичную массу. В литровую стерильную колбу с бу­сами асептично вносят содержимое 20-22 куриных яиц (свежих), пе­ремешивают, фильтруют через марлю. К 1000 мл яичной смеси до­бавляют 20 мл стерильного 2%-ного раствора малахитового зелено­го и перемешивают.

К 1 л яичной смеси с малахитовым зеленым добавляют 600 мл солевого раствора с крахмалом, выдерживают около одного часа до исчезновения пузырьков, асептично разливают по 8-10 мл в про­бирки и в скошенном положении в аппарате Коха прогревают при 80-85°С 40 минут. Далее выдерживают в термостате для контроля стериль­ности. Хранят на холоде. Если среду используют для определения ле­карственной устойчивости микроорганизмов, крахмал не добавляют.

Яичная среда Гельберга. Пять свежих куриных яиц моют, обтира­ют спиртом, слегка обжигают, вскрывают. Асептично извлекают два желтка и помещают их в стерильную колбу с бусами, встряхивают. Добавляют 50 мл солевого раствора, 50 мл молока, 50 мл кар­тофельного отвара, 2,5 мл 10%-ного стерильного раствора лимон­ной кислоты. Компоненты перемешивают, добавляют 3,5 мл 2%-ного раствора малахитового зеленого и вновь содержимое колбы тщатель­но перемешивают. Смесь фильтруют через стерильную марлю и по 4-6 мл разливают в пробирки. Стерилизуют в аппарате Коха при 85°С 60 минут однократно. Готовую питательную среду для контроля стериль­ности выдерживают 48 ч в термостате. Используют в течение недели после изготовления при хранении на холоде.

Приготовление картофельного отвара. Очищенный и нарезанный картофель заливают двойным (по весу) количеством воды, кипятят 15 минут, отстаивают, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают в колбы по 110 мл и стерилизуют при 120°С 20 минут.

Приготовление молока. Снятое коровье молоко раз­ливают по 110 мл в колбы, стерилизуют первый день при 105°С 10 минут и второй — 15 минут текучим паром.

2%-ный раствор малахитового зеленого стерилизуют при 120°С 20 минут. 10 г кристаллической лимонной кислоты растворяют в 100 мл дистиллированной воды, разливают по 10 мл в пробирки и стерили­зуют 20 минут при 120°С.

Приготовление солевого раствора. Берут К₂НРO₄ — 1 г, натрия лимоннокислого — 1 г, магнезии сернокислой — 1 г, пептона — 6 г, глицерина химически чистого — 30 мл, воды дис­тиллированной — до 1000 мл. Каждый компонент растворяют в не­большом количестве воды, потом вносят глицерин и добавляют дис­тиллированную воду до 1000 мл. Смесь слегка подогревают, фильтру­ют через бумажный фильтр, разливают в колбы по 110 мл и стерилизу­ют 20 минут при 105°С.

Картофель Павловского. Белый картофель тщательно моют с мы­лом, насухо вытирают, очищают, прокаленным ножом срезают оба полюса картофелины. Специальным стерильным бором вырезают из картофеля цилиндры длиной 5—6 см, шириной в соответствии с диа­метром пробирки. Цилиндры по диагонали разрезают на два клина и опускают последние в 5%-ную стерильную глицериновую воду на 1-2 ч. Далее клинья подсушивают при помощи стерильной фильтро­вальной бумаги и пинцетом опускают в пробирки Ру с перетяжкой, содержащие в нижней части 5%-ную стерильную глицериновую воду (рН 7,0-7,2), с расчетом, чтобы нижняя часть картофельного клина касалась жидкости. Пробирки стерилизуют при 110°С 10 минут. Сразу после стерилизации пробирки размещают в наклонном положении поверхностью посевов вниз, что позволяет сохранить их влажными. Стерильность контролируют выдерживанием пробирки в термостате в вертикальном положении двое суток. Хранят на холоде.

Среда Петрова. Приготавливают компоненты. Смешивают 500 г мясного говяжьего фарша с 500 мл 15%-ной глицериновой воды и выдерживают 24 ч на холоде. Перед употреблением фильтруют.

Асептически извлекают содержимое куриных яиц, помещают в мерный цилиндр и перемешивают. Далее готовят 1%-ный спиртовой раствор генцианвиолета и выдерживают 24 ч в термостате. Для изготовления среды в 1 часть мясного настоя вносят 2 час­ти яичной смеси и 1 мл раствора генцианвиолета на каждые 100 мл среды. Компоненты тщательно перемешивают, разливают по пробир­кам и прогревают первый день при 85°С, а два последующих дня — при 75°С по 45-60 минут. Готовую среду контролируют на стерильность, выдерживая в термостате 3-5 дней.

Яично-картофельная среда Виноградова. Вымытый, очищенный и нарезанный мелкими кусочками картофель заливают водой (1:2) и варят при 120°С 1,5 ч. Горячий отвар фильтруют через марлю. В фильтрат вносят 1% пептона, 0,5% натрия хлорида, 5% глицерина. Смесь стерилизуют в автоклаве и используют по мере необходимос­ти. При изготовлении среды к 1 части картофельного отвара добавля­ют 2 части яичной смеси, перемешивают, разливают по пробиркам и прогревают при 90°С. Затем в каждую пробирку вносят 0,5-1,0 мл МПБ с глицерином или картофельного отвара и повторно стерилизу­ют при 100°С два дня по 45 минут.

Среда Дорсе. Вымытые куриные яйца помещают на 10-15 минут в сосуд с этиловым спиртом, затем обжигают на пламени горелки, со­держимое асептично переносят в колбу с известным весом и долива­ют 10% (вес/вес) дистиллированной воды. Смесь тщательно переме­шивают, фильтруют через стерильную марлю, разливают по пробир­кам и свертывают в наклонном положении при 70-75°С 60 минут. Конт­ролируют на стерильность, выдерживая 3 суток в термостате.

Среда Международной лиги борьбы с туберкулезом (MIUT). Сре­да Левенштейна-Иенсена без крахмала. Пробки в пробирках гер­метизируют парафином, хранят при 4°С. Среда пригодна для исполь­зования в течение полугода.

Кислотная яичная среда N ^o 1a (Zaher, Marks, 1977). В 600 мл дис­тиллированной воды растворяют 6,3 г КН₂РO₄, 0,3 г MgSO₄ ´ 7Н₂O, 12 мл глицерина и автоклавируют при 110°С 15 минут. К раствору асептически добавляют 1100 мл полной яичной смеси, 3 мл 1 н НСl, 11 мл раствора малахитового зеленого (2%-ный вес/объем) и 100 000 ЕД натриевой соли пенициллина. Среду разливают по пробиркам, прогре­вают при 75-85°С 45 минут.

Кислотная яичная среда N ^o 1b. Готовится аналогично среде N ^o 1а, вместо глицерина добавляют 7 г натрия пирувата.

Кислотная яичная среда N ^o 2а (Zaher, Marks, 1977). В 600 мл дис­тиллированной воды растворяют 2,4 г КН₂РО₄, 0,3 г MgSO₄ ´ 7H₂O, 12 мл глицерина, автоклавируют при 110°С 15 минут. Солевой раствор асептично смешивают с 1000 мл полной яичной смеси, добавля­ют 40 мл 1 н НСl, 10 мл раствора малахитового зеленого (2%-ный раствор вес/объем) и 100 000 ЕД натриевой соли пенициллина.

Кислотная яичная среда N ^o 2b. Готовится аналогично среде N ^o 2а, глицерин замещают 7 г натрия пирувата.

Кислотные яичные среды предназначены для выделения возбу­дителя туберкулеза из материалов, подвергнутых обработке различ­ными способами. Для посева высокощелочных инокулятов рекомен­дуются среды N ^o 1а и 1b, нейтральных и кислых — N ^o 2а и 2b, без добавления НСl (Zaher, Marks, 1977).

Глицериновый МПБ. К МПБ добавляют 5-10% химически чисто­го глицерина, рН 7,2, стерилизуют при 110°С. На основе глицеринизированного МПБ, добавляя агар-агар, готовят глицериновый МПА.

Синтетическая среда Сотона. В 940 мл дистиллированной воды растворяют 0,5 г двухосновного фосфорнокислого калия, 0,5 г серно­кислой магнезии, 0,05 г лимоннокислого аммиачного железа, 2 г лимон­ной кислоты, 4 г аспарагина, 60 мл глицерина химически чистого.

Кровяная среда. Непосредственно перед посевом дистиллирован­ной водой 1:2-1:3 разводят стерильную нитратную кровь, разли­вают по 3 мл в пробирки и вносят раствор пенициллина из расчета 2 ЕД/мл (Тогунова, 1973).

Синтетическая среда Вишневского. Берут 3 г аспарагина, 7 г щаве­левокислого аммония, 5 г двухосновного фосфорнокислого калия, 0,5 г сернокислого магния, 0,05 г сернокислого железа, 40 мл глице­рина и дистиллированной воды до 1000 мл. Подщелачивают до рН 6,8-7,2, фильтруют через бумажный фильтр и стерилизуют 30 минут при 120°С.

Среда Данкина. Используют для культивирования М. paratuberculosis. На 4%-ном глицериновом бульоне выращивают 10-15 суток куль­туру М. phlei. Путем фильтрации через бу мл мажный фильтр отделяют бактериальную массу, переносят ее в ступку с 10 мл глицерина и 100 мл печеночного экстракта Дедляу. Смесь несколько минут кипя­тят, отстаивают и надосадочную жидкость сливают в мерный сосуд, добавляют содержимое трех куриных яиц. Перемешивают и вносят 2,5% (объем/объем) 1%-ного спиртового раствора генцианвиолета. Фильтруют через стерильную марлю, разливают по пробиркам и по­мещают в аппарат для свертывания. Стерилизуют дробно, первый день при 80°С до уплотнения среды и два дня подряд по 60 минут при 80°С.

Печеночный экстракт по Дедляу. В 1000 мл воды вносят 400 г говяжьей печени, стерилизуют 120 минут текучим паром и фильтруют через марлю. Устанавливают рН 7,0. Фильтрат разливают по емкостям и стерилизуют при 100°С по 20 минут в течение 3 дней.

Среда Ренжара. Используют для культивирования М. paratuberculosis. Смешивают 4 части печеночного (рН 7,3) и 8 частей телячье­го бульона (рН 7,3), добавляют 3% агар-агара. После растворения агара смесь фильтруют, вносят 5% глицерина и 1 часть глицериновой вытяжки из М. phlei, стерилизуют при 115°С 20 минут. Среду охлажда­ют до 55°С. Добавляют 1 часть сыворотки крови крупного рогатого скота, прогретой при 56-58°С, разливают по пробиркам и окраши­вают.

Приготовление вытяжки из М. phlei. Бактериаль­ную массу М. phlei, выращенную на глицериновом бульоне, фильтру­ют через бумажный фильтр. 5 г биомассы растирают с 30 мл 20%-ного раствора глицерина в дистиллированной воде, встряхивают, прогрева­ют при 110-120°С 1,5 ч. Центрифугированием отделяют жидкую часть, которую и используют для изготовления среды.