Питательные среды для культивирования пастерелл

Пригодны общепринятые плотные и жидкие питательные среды, однако при выделении из патологического материала следует применять среды, обогащенные кровью, сывороткой крови, дрожжевым экстрак­том.

Идентификация Р. multocida сероварианта А с использованием гиалуронидазы стафилококка.

Метод основан на способности гиалуронидазы, выделяемой стафилококком, деполимеризовать капсулу Р. mul­tocida сероварианта А, состоящую из гиалуроновой кислоты.

На поверхность агара Хоттингера в чашке Петри штрихом высева­ют суточную бульонную культуру Р. multocida. После этого перпенди­кулярно линиям посева по всему диаметру чашки петлей высевают суточную бульонную культуру Staphylococcus aureus. Чашки с посевами инкубируют при 37°С с периодическим просмотром в течение 24 ч. Деполимеризующее действие гиалуронидазы проявляется уменьшением размера колоний пастерелл и примыкающих к линии роста стафилокок­ков. При просмотре чашек в косопроходящем свете колонии Р. multo­cida сероварианта А, находящиеся в непосредственной близости от линии роста стафилококка, тусклые, серого или голубого цвета, в то время как остальные колонии — яркие, флюоресцирующие. У колоний, об­разуемых другими серовариантами (В, D, Е), изменений в размерах и окраске не наблюдается.

Идентификация Р. multocida сероварианта D с использованием акрифлавина.

Испытуемую культуру высевают на агар Хоттингера с 10% крови быка или барана и инкубируют при 37°С 24 ч, затем пе­ресевают в пробирки, содержащие 3 мл бульона Хоттингера. Инку­бируют при 37°С 18-24 ч. Бульонные культуры переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют в режиме, обеспечивающем осаж­дение бактериальных клеток. После центрифугирования 2,5 мл надосадочной жидкости сливают, а в оставшейся ресуспендируют осевшие клетки и добавляют 0,5 мл свежеприготовленного водного раство­ра (1:1000 - 1:500) нейтрального акрифлавина (синий трипафлавин, флавакридин, флавин). Перемешивают и оставляют при комнатной температуре.

Если испытуемая культура относится к сероварианту D, то в те­чение 10-20 минут образуется крупнохлопчатый осадок. Штаммы дру­гих серовариантов (А, В, Е) в осадок не выпадают и сохраняют ста­бильность суспензии в течение длительного времени (от нескольких часов до суток и более).

Микроорганизмы рода Brucella

Brucella — бактерии, представляют собой мелкие (0,5-0,7´0,6-1,5 мкм) неподвижные палочки или коккобациллы. В мазках обычно расположены одиночно, реже парами, короткими цепочками, небольшими группами. Легко окрашиваются анилиновыми красителями, грамотрицательны. Полноценного биполярного окрашивания обычно не обнаруживают. Настоящих капсул не имеют, спор не образуют. Неподвижны, жгутиков не образуют.

Хемоорганотрофы, метаболизм дыхательный; для роста необходи­мы тиамин, ниацин и биотин; рост часто стимулирует внесение пантотената кальция. Восста­навливают нитраты (исключая Brucella ovis); каталазоположительны и обычно оксидазоположительны, цитрат не утилизируют; индол не образуют; реакции с метиловым красным и Фогеса-Проскауэра отрицательные. Строгие аэробы (некоторые нуждаются в уве­личении концентрации СО₂ до 5-10%); растут в пределах 20-40°С (оптимальная температура 37°С); оптимум рН 6,6-7,4. Факультативные внутриклеточные паразиты; человек заболевает при непосредственном контакте с больным животным (доярки, скотники), а также при употреб­лении в пищу зараженных продуктов.

Патогенные для человека Brucella abortus (палочка Банга), В. melitensis, В.suis, В. canis и их биотипы вызывают бруцеллез (также известен как ундулирующая, средиземноморская, мальтийская лихорадка или болезнь Банга). Заболевание описывал еще Гиппократ, но как самостоятельную нозоединицу его предложил выделить Мерстон в 1860 г. Возбудитель бруцеллеза был открыт и выделен английским медицинским врачем Брюсом (1986,1887) из селезенки погибшего от этой инфекции солдата из гарнизона на Мальте и позднее назван Brucella melilensis. В 1904-1907 гг. Заммитом была установлена теснейшая связь инфекции людей и потреблением козьего молока и выявлено, что козы и козье молоко являются источником и резервуаром инфекции для людей. В 1897 датские ветеринарные врачи Банг и Стрибольт из околоплодной жидкости коровы выделили второй вид - Brucella abortus (палочка Банга). В 1914 г. Траумом, а затем в 1916 г. Гудом и Смитом выделен возбудитель инфекционного аборта свиней, названный позднее - В. suis. В 1918 году американская исследовательница Ивенс, изучив биологические и серологические свойства всех трех культур, установила их большое сходство. Результаты этих наблюдений были подтверждены Майером и Фезье (1920), которые и предложили объединить данные микроорганизмы в одну группу.

Распространение

Резервуар и источник инфекции — домашние животные (овцы, козы, коровы, свиньи, реже собаки). Человек — вторичный хозяин; заболевания людей, исключая случаи лабораторного заражения, возникают на фоне эпизоотии. Бактерии передаются от животного к животным и человеку через контакт с зараженными фекалиями, мочой, молоком и мясом. Как правило, каждый из патогенных для человека видов бруцелл избирательно инфи­цирует специфических животных; Brucella abortus чаще вызывает бруцеллез у крупного рогатого скота (болезнь Банга), В. melitensis — у коз и овец (иногда кур), В. suis — у свиней. Резервуар отдельных биотипов последнего вида — также зайцы, а в районах Край­него Севера РФ, на Аляске (США), северо-западных территориях и Юконе (Канада) источ­ником заражения могут быть северные олени (карибу).

В США и РФ заболеваемость людей бруцеллезом носит, прежде всего, профессиональный характер. Возбудитель внедряется в организм человека через поврежденную кожу, сли­зистую оболочку дыхательных путей и ЖКТ, конъюнктиву. Контактный путь заражения более характерен для овечьего и свиного бруцеллеза.

В странах, где отсутствует массовая пастеризация молочных продуктов, бруцеллез более распространен. Например, в Испании ежегодно регистрировали около 100000 случаев бру­целлеза. Большинство из них вызвано употреблением в пищу зараженных молока и сыра.

Морфология

Клетки отличаются выраженным полиморфизмом: в одном препарате наблюдаются кокки и удлиненные палочки (особенно в молодых культурах). Клетки Brucella melitensis чаще представлены кокковидными формами, В.abortus и В. suis — палочками с закругленными концами. Возможно наличие капсул у некоторых видов, выявляемых при культивирова­нии на среде Дорсе, на средах, содержащих 10% иммунной сыворотки барана или лоша­ди, а также при выращивании на куриных эмбрионах. Капсульные культуры можно полу­чить и при воздействии специфическим бактериофагом.

Колонии видов Brucella мелкие, выпуклые и гладкие, мутноватые, с перламутровым оттенком (S-формы); первые генерации при посеве из органов развиваются довольно медленно (2 недели и больше), при пересевах лабораторных культур обычно достаточно 2-5 суток. В процессе диссоциации образуют шероховатые R-колонии. Нуждаются в сложных, обогащенных средах содержащих несколько аминокислот, тиамин, никотинамид и ионы магния. Brucella abortus дает опти­мальный рост в атмосфере, содержащей 5-10% СО₂. Рост бруцелл стимулирует внесение в питательную среду 5% глицерина или сыворотки. Сыворотка и кровь стимулируют рость, но гемин (Х-фактор) и НАД (У-фактор) влияния на рост не оказывают. Для выращивания обычно применяют триптозный, триптозо-казеиново-соевый и кровяной (5% овечьей крови) агар; оптималь­ная среда для культивирования — печеночный агар Хеддльсона. При выращивании для проверки диссоциации культур применяют 1% декстрозный агар с добавлением 2% глице­рина (можно дополнить внесением 5% сыворотки).

Антигенный состав

Различные виды бруцелл практически неразличимы в реакциях про­стой перекрестной агглютинации, что впервые установила Ивенс (1918). Поверхностные Аг бруцелл дифференцируют истощением агглютининов по Кастелгани. Серологические свой­ства бактерий представлены в табл. 18.

Два главных поверхностных Аг, А и М, имеют количественные видовые различия; соотношение для Brucella melitensis составляет 1:20, для В. abortus и В. suis — 2:1. Для их идентификации применяют соответствующие антисыворотки.

Третий поверхностный Аг — термолабильный L-Аг, имеющий сходство с Vi-Аг сальмонелл.

Шероховатые формы содержат специфический R-Аг; для его идентификации применяют специфические антисыворотки, используемые при серотипировании бруцелл.

Таблица 18. Дифференциальные серологические признаки рода Brucella

Вид и биотип	Агглютинация антисывороткой
А-моноспецифическая	М-моноспецифическая	Анти-R (антишероховатая)
B. melitensis:
	–	+	–
	+	–	–
	+	+	–
B.abortus:
	+	–	–
	+	–	–
	+	–	–
	–	+	–
	–	+	–
	+	–	–
	+	+	–
	–	+	–
	–	+	–
В.suis:
	+	–	–
	+	–	–
	+	–	–
	+	+	–
В neotomae	+	–	–
В. ovis	–	–	+
В. canis	–	–	+