Питательные среды для культивирования и идентификации псевдомонад

Среда Кинга А. Пептон — 20,0 г, глицерин — 10,0 г, калий серно­кислый — 10,0 г, магний хлористый — 1,4 г, агар — 20,0 г, вода дис­тиллированная — до 1000,0 мл.

Среда Кинга В. Пептон — 20,0 г, глицерин - 10,0 г, калий фосфор­нокислый двузамещенный — 1,5 г, магний сернокислый — 1,5 г,агар — 15,0 г, вода дистиллированная — до 1000,0 мл (рН 7,2).

Среда Мак-Конки. Пептон — 20,0 г, лактоза — 10,0 г, натрий хло­ристый — 5,0 г, таурохолат натрия — 5,0 г, нейтральный красный — 0,03 г, агар — 20,0 г, вода дистиллированная — до 1000,0 мл (рН 7,4).

Среда Хью-Лейвсена. Пептон — 2,0 г, агар - 3,0 г, натрий хлорис­тый — 5,0 г, калий фосфорнокислый двузамещенный — 0,3 г, 0,2 %-ный водный раствор бромтимолового голубого — 15,0 мл, глюкоза — 10,0 г, дистиллированная вода — до 1000,0 мл.

Цетримидный агар. Пептон — 20,0 г, агар —13,0 г, магний хлористый — 1,4 г, калий сернокислый — 10,0 г, цетримид (цетилтриметиламмония бромид) - 0,3 г, глицерин — 10,0 г, вода дистиллированная — до 1000,0 мл (рН 7,2).

Селективная среда (Мороз, Бекбергенов, Афиногенов). Пептон — 20,0 г, агар — 10,0 г, калий сернокислый — 7,0 г, магний хлористый — 15,0 г, магний сернокислый — 1,5 г, цетилпиридиния хлорид — 2,0 г, вода дистиллированная — до 1000,0 мл (рН 6,8-7,0).

Среда с ацетамидом. Агар — 15,0 г, натрий хлористый — 5,0 г, маг­ний сернокислый — 0,2 г, аммоний фосфорнокислый однозамещенный — 1,0 г, калий фосфорнокислый двузамещенный — 1,0 г, ацетамид — 20,0 г, вода дистиллированная — до 1000,0 мл (рН 6,7).

Среда Паллерони—Дудорова. Хлористый аммоний — 1,0 г, маг­ний сернокислый — 0,5 г, железо аммоний цитрат — 0,05 г, хлористый кальций — 0,005 г, 0,33 М Na-К фосфатный буфер (рН 6,8) — до 1000 мл. Первые два ингредиента добавляют к буферному раствору и автоклавируют при 115°С 30 минут. Железа аммонийцитрат и хлорис­тый кальций стерилизуют путем фильтрации и вносят в основной раст­вор асептически (перед засевом среды).

Картофельно-глицериновая среда. Вырезанные из очищенного кар­тофеля цилиндры диаметром 1 см и длиной 4-5 см разрезают по диаго­нали для получения клиньев. Клинья выдерживают 2 ч в 1%-ном раство­ре бикарбоната натрия, после чего подсушивают и в течение 2 суток выма­чивают в 5-6%-ной глицериновой воде или бульоне. Опускают основа­нием вниз в пробирки с 5%-ной глицериновой водой. Для того чтобы картофель не касался глицериновой воды, используют пробирки с пере­тяжкой в нижней части или в них опускают короткие стеклянные палоч­ки. Среду автоклавируют при 115-120°С 20 минут.

Пробирки со средой хранят в наклонном положении плоской по­верхностью картофеля вниз (с целью сохранения поверхности для по­сева влажной).

Микроорганизмы рода Frаncisella

Francisella — мелкие кокковидные (до эллипсоидных) при культивировании на подходящей среде, впоследствии плеоморфные палочки; неподвижные, спор не образуют. Строгие аэробы; не растут на обычных средах; расщепляют некоторые угле­воды с образованием кислоты, образуют H₂S. Распространены во многих пресноводных водоемах; могут паразитировать у человека, млекопитающих, птиц и членистоногих; род представ­лен видами Francisella novicida (известен один уникальный штамм, выделенный из озерной воды в США) и Francisella tularensis (возбудитель туляремии — болезнь Фрэнсиса). Заболе­вание впервые описано японскими врачами (1837). До открытия Охарой (1925) новой бакте­рии, названной кокком Охары-Хагч, болезнь не связывали с конкретным возбудителем. Как возбудитель чумоподобной лихорадки земляных белок (Cytellus beechei) микроорганизм также выделили Маккой и Чепин (1911) в районе озера Туляре (графство Туляре, штат Калифорния). Позднее была установлена эпидемическая связь заболевания с кровососущими членистоногими (1924), лишь в 1928 г. Фрэнсис доказал идентичность туляремии и болезни Охары. Нозогеографически туляремия принадлежит к распространенным инфекциям, ее регистрируют повсемест­но в Северном полушарии (исключая Англию) в ареале между 30° и 70° с. ш. На территории РФ впервые официально выделена данная культура С. Суворовым и др. в 1926 г (Астраханская область). Возбудитель диффе­ренцируют на экологогеографические расы и варианты. Тип A (Nearctica) выделяют от многих грызунов и кровососущих насекомых; высоковирулентен для человека и кроликов; ферментиру­ет глицерин, содержит цитруллинуреидазу. Тип распространен в Северной Америке; очень па­тогенен для человека. Тип В (Palaearcticа) выделяют из воды и от водных животных; маловирулентен для человека и кроликов; не ферментирует глицерин, не содержит цитруллинуреидазу. Возбудитель регистрируют в Европе и Азии; не ферментирует глицерин, умеренно патогенен для домашних кроликов и человека, вариант japonica выделяют в Японии (ферментирует глицерин), вариант mediasiatica вызывает заболевания в Средней Азии в дельтах рек Или и Аму-Дарьи (ферментирует глицерин, содержит цитруллинуреидазу; умерен­но патогенен для домашних кроликов и человека).

Распространение

Francisella tularensis выделена от многих диких и домашних животных, а также птиц, рыб и земноводных. Основные источники заражения человека — обыкновен­ные полевки (Microtus arvalis), домовые мыши (Mus musculus), водяные крысы (Arvicola terrestis), ондатры (Ondathra zibethica), а также зайцы, особенно русак (Lepus europeus) и беляк (L. timidus). Переносчики инфекции — кровососущие членистоногие: иксодовые и гамазовые клещи, блохи, слепни (оленьи мухи), комары, москиты.

На юго-западе США бактерии выделяют из оленьих мух; на северо-западе — из лесных клещей. На востоке США возможными источниками инфекции для человека считают белок-летяг (Pternmyidae).

Человек заражается от больных животных, кровососущих членистоногих или объектов внешней среды. Пути заражения: контактный (через кожу и слизистую оболочку глаз), инокулятивный (при укусе переносчика), алиментарный (через ЖКТ) и аспирационный (через дыхательные пути).

Морфология

Клетки Francisella tularensis — мелкие (размером 0,1-0,5 мкм), неподвижные капсулированные грамотрицательные палочки с выраженным полиморфизмом (от кокковидных до нитевидных форм), особенно у неарктических видов. В мазках из культур доминируют кокковидные формы, в мазках из органов — коккобактерии, которые возможно слабо воспринимают краси­тель и окрашиваются бледнее, чем прочие патогенные микроорганизмы, однако бактерии легко воспринимают краску Гимзы; в мазках-отпе­чатках не дают биполярной окраски, что отличает их от возбудителя чумы, но в чистой культуре могут окрашиваться биполярно. Размножают­ся почкованием. Отличий в микроструктуре клеток различных рас не отмечают: у авирулентных штаммов находят массированное подобие капсулы, у вирулентных — не­стойкое слизистое вещество. Клеточная стенка имеет гладкие контуры.

Колонии. На обогащенных агаровых средах колонии Francisella tularensis мелкие, в виде капелек беловатого цвета с голубо­ватым отливом, круглые, с ровным краем, выпуклые и блестящие. При разре­женном посеве через несколько суток достигают диаметра 2 мм и более (рост становится заметным с 3-5 суток культивирования). Изолированные колонии удобно получать при посеве на среды О. Емельяновой или Маккоя; используют также агар с переваром сердеч­ной мышцы, дополненный 5% крови барана или кролика. Колонии вирулентных штаммов по морфологии и биологическим свойствам соответствуют S-диссоциатам. На жидких средах размножаются хуже и только у поверхности среды, что связано, по-видимому, с аэрофильностью бактерий; более удовлетворительных результатов достигают аэрацией среды или внесением биоколлоидов (яичного желтка, агара и т.д.).

Культуральные свойства

У Francisella tularensis оптимальный рост наблюдают только в аэробных условиях; температурный оптимум 36-37°С (пределы 5-43^оС). Бактерии культивируют на сложных агаровых или желточных средах с добавлением тканевых экстрактов, цистеина, кроличьей дефибринированной крови и других питательных веществ. Включение в питательную среду полимиксина В или пенициллина подавляет рост других микроорганизмов. Ферментируют до кислоты глюкозу, мальтозу, ле­вулезу и маннозу (американские, среднеазиатские и японские штаммы дополнительно и глицерин), но определить эту способность можно только на специальных средах с ограни­ченным содержанием белка и точно определенным рН: наиболее точные результаты ферментации углеводов и спиртов получают манометрией на аппарате Варбурга. Имеют следующие ферменты: каталазу, глутаминазу, аспарагиназу, дез- и трансаминазу, цитруллинуреидазу. Индол не образуют, продуцируют аммиак и сероводород, редуцируют некоторые краски, например тионин, метиленовый синий, малахитовый зеленый и др. Работа с кровью, мокротой или аспиратами лимфатических узлов больного связана с большим риском для сотрудников лаборатории и предъявляет особые требования к ее оснащению и квалификации персонала.

Патогенез

После проникновения возбудителя в организм его дальнейшее распростране­ние происходит, как правило, с током лимфы и реже через кровоток, куда он попадает позднее (что создает угрозу генерализации). Фагоциты активно поглощают Francisella tularensis, но они не способны к их внутриклеточному киллингу, что создает предпосылки для депонирования бактерий в лимфатических узлах. Часть возбудителей при этом погиба­ет, что сопровождается выделением эндотоксина, действующего на узел и окружающие ткани. Таким образом, вслед за стадией лимфогенного заноса развивается стадия очаговых реакций, в результате чего формируются туляремийные бубоны. По аналогии с чумой человека последние разделяют на первичные (возникают метастатически лимфогенно и связаны с местом входных ворот) и вторичные, а также на бубоны первого порядка, второго и т.д., учитывая время их появления. Периодически из сформированных очагов возбудитель про­никает в лимфо- и кровоток, что сопровождается выделением новых порций эндотоксина и сенсибилизацией (регистрируют кожными пробами). Прорывы бактерий могут приводить к метастазированию в печень, селезенку, легкие, костный мозг и другие органы, что обуслов­ливает вторичные поражения (например, вторичную пневмонию, менингит и т.д.).

Лабораторная диагностика

Предположительный диагноз основывают на соответствую­щем анамнезе и клинических проявлениях.

Наиболее достоверные результаты дает выделение Francisella tularensis (рис. 14), одна­ко культивирование возбудителя сопряжено не только с трудностями, но и с угрозой заражения персонала и разрешено только в лабораториях особо опасных инфекций.

Рисунок 14. Принципиальная схема бактериологического выделения возбудителя туляремии

При отсутствии возможности выделения возбудителя используют биологический ме­тод, основанный на заражении лабораторных животных (мышей или морских свинок) патологическим материалом (пунктат бубона, слизь из зева, гнойное отделяемое слизис­той оболочки глаза, кровь и т.д.) с последующей идентификацией микроба агглютиниру­ющей сывороткой. Материал из бубона следует брать до 14-20 суток болезни, из слизис­той оболочки глаза — до 17 суток, кровь — до 6 дня заболевания.

Серологические методы. Наличие AT к Francisella tularensis в сыворотке больного определяют в реакции агглютинации с туляремийным диагностикумом; положительной считают видимую глазом реакцию при разведении сыворотки 1:100 и больше (положи­тельные результаты на 1 неделе выявляют у 12,5% больных, на 4 — у 93,2%). Возможна экспресс-диагностика, основанная на идентификации Аг в мазках из очагов поражений AT, меченными флюоресцеинами.

Для ранней диагностики эффективна аллергическая кожная проба. В качестве Аг используют тулярин — взвесь бактерий, убитых нагреванием до 70°С.