Питательные среды для культивирования микоплазм

Среда Мартена. В 1 л теплой (50°С) кипяченой водопроводной воды суспендируют 250 г фарша из свежих свиных желудков и добавляют 10 мл концентрированной соляной кислоты. Смесь выдер­живают 24 ч при 45-50°С, периодически перемешивая. Прогревают 30 минут текучим паром и оставляют на 5 суток при 4°С. Надосадочную прозрачную жидкость декантируют, фильтруют через бумажный фильтр, разливают в колбы и стерилизуют 30 минут при 120°С.

Модифицированная плотная среда ВИЭВ. К горячему 20%-ному агару на дистиллированной воде добавляют смесь (поровну) среды Мартена и мясной воды с таким расчетом, чтобы получить 1,5-2%-ную концентрацию агара. Далее разливают в колбы и стерилизуют 30 минут при 120°С. Перед использованием в расплавленный и остуженный до 45-50°С агар добавляют 10% дрожжевого экстракта, 20% стериль­ной сыворотки крови лошади и 0,5% глюкозы.

Модифицированная жидкая среда ВИЭВ. Смешивают равные объе­мы среды Мартена и мясной воды, устанавливают рН 8-8,2 и стерили­зуют 30 минут при 120°С. Перед использованием в среду добавляют 10% стерильного дрожжевого экстракта, 20% сыворотки крови ло­шади и 0,5% глюкозы.

Среда Эдварда. Смешивают 500 мл отвара сердечной мышцы, 500 мл водопроводной воды и 10 г пептона. Устанавливают рН 8,4. Стерилизуют 30 минут при 120°С. Перед использованием в среду асеп­тически добавляют 20% инактивированной сыворотки крови лошади или крупного рогатого скота и 10% дрожжевого экстракта. Для получения полужидкой или плотной среды Эдварда к жид­кой среде добавляют соответственно 3 или 20 г агар-агара.

Приготовление отвара сердечной мышцы. К 1 л дистиллированной воды добавляют 1 кг фарша из мышцы сердца крупного рогатого скота и оставляют на 16-18 ч, периодически пе­ремешивая. Кипятят 40 минут, отстаивают, надосадочную жидкость фильтруют через бумажный фильтр. Полученный отвар разливают в колбы и стерилизуют 30 минут при 120°С.

Приготовление дрожжевого экстракта. В 200 мл дистиллированной воды суспендируют 50 г хлебных (пекарс­ких) дрожжей, нагревают до закипания с пенообразованием. Охлаж­дают, после центрифугирования надосадочную жидкость стерилизуют фильтрованием через фильтр Зейтца. Экстракт пригоден в течение 2 недель.

Среда Надь-Погани. В 1 л дистиллированной воды растворяют 2,5 г натрия хлорида, 0,075 г пептона, 2,5 г гидрофосфата натрия. Добавляют 1 мл 2,4%-ного водного раствора фенолового красного. Устанавливают рН 8,0-8,2. Стерилизуют 30 минут при 120°С. Перед использованием в среду асептически добавляют 200 мл дрожжевого экстракта и 200 мл стерильной сыворотки крови лошади.

Среда из гидролизата мышцы сердца крупного рогатого скота. Сме­шивают 1 часть фарша из мышцы сердца крупного рогатого скота с 1,5 частями дистиллированной воды, кипятят 10-15 минут. Остыв­шую массу пропускают через мясорубку, отстаивают. К 600 г отстояв­шегося фарша добавляют 1 л полученного бульона. Устанавливают рН 8,0. Вносят 150 г измельченной свежей поджелудочной железы круп­ного рогатого скота и 30 мл хлороформа. Оставляют в закрытой бу­тыли в темном месте при 45-48°С на 10 сут. Периодически переме­шивают. Надосадочную жидкость фильтруют через ватно-марлевый или полотняный фильтр. Устанавливают рН 8,0. Добавляют 2% хло­роформа и хранят при 4-8°С. К 200 мл гидролизата сердечной мышцы добавляют 400 мл мяс­ной воды, 400 мл дистиллированной воды, 5 г натрия хлорида. Уста­навливают рН 8,2. Прокипятив 15-20 минут, фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Стерилизуют 30 минут при 120°С.

Среда Хофстад-Доерр. В 2 части дистиллированной воды вносят 1 часть фарша из мяса, сердца и печени кур, перемешивают. Выдержи­вают 12 ч при 4-8°С. Прогрев на водяной бане (кипящей) 30 минут, фильтруют через ватно-марлевый фильтр. К фильтрату добавляют 0,5% натрия хлорида, 5% крови птиц. Устанавливают рН 7,8 и кипятят 30 минут на водяной бане. Фильтруют, добавляют 0,5% мальтозы, 20% сыворот­ки крови птиц, ацетат таллия и пенициллин в конечной концентрации 1:4000 и 100 ИЕ на 1 мл соответственно. Стерилизуют фильтрованием через фильтр Зейтца.

Группа Rickettsiaceae

Представители данной группы – Rickettsiaceae представлены небольшими плеоморфными (палочки, кокки и дипло­кокки) микроорганизмами; грамотрицательны, культивирование на бесклеточных средах невозможно. Они подразделяются на несколько видов: виды, патогенные для паукообразных, членистоногих, теплокровных и человека; пере­носчики — вши, блохи и клещи; вызываемые заболевания называют риккетсиозами. По типу дыхания — аэробы, поглощают О_2, выделяют СО_2, дыхание своеобразно — клетки активно окисляют глутаминовую кислоту и индифферентны к глюкозе. Систематическое положение многих видов остается спорным; подавляющее большинство патогенных риккетсий входит в состав родов: Rickettsia, Rochalimea и Coxiella, спорадические заболевания также вызывают виды семейства Ehrlichia (Е. chaffeensis и Е. sennetsu). Основоположник современного учения о риккетсиозах — бразильский бактериолог да Роха-Лима, впервые применивший термин «риккетсия» (1916) для обозначения возбудителя сыпного тифа в память американского бактериолога Риккетса, погибшего при его исследовании (1910).

Морфология патогенных риккетсий (род Rickettsia)

Строение аналогично строению прочих бактерий; у риккетсий выделяют оболочку, протоплазму и зернистые включения. Ядерная структура представлена зернышками (от 1-2 до 4); в клетках выявляют ДНК и РНК. Для микроорганизмов, особенно для риккетсий сыпного тифа, характерен полиморфизм, выявляемый при помощи специальных методов окрашивания; изменений вирулентности в зависимости от того или иного морфологического типа не наблюдают. По П.Ф. Здродовскому (1972) выделяют следующие типы:

Тип а. Кокковидные мелкие гомогенные зернистые клетки овоидно-эллипсоидной формы (около 0,5 мкм); часто образуют диплоформы (в виде гантелей) или конгломераты; являются основной морфологической формой, типичны для интенсивного размножения возбудителя в клетках.

Тип b. Палочковидные двузернистые образования (зерна расположены на полюсах, связаны плохо окрашиваемой протоплазмой); средний диаметр 1-1,5 мкм; также характерны для интенсивного размножения возбудителя.

Тип с. Удлиненные (или изогнутые) двузернистые палочки (3-4 мкм); иногда могут включать по 4 зернышка, парно расположенных на полюсах; соответствуют более медленному размножению (занимают промежуточное положение между типами a, b и d).

Тип d. Нитевидные (до 20-40 мкм) многозернистые формы, представляющие своеобразный «мицелий» из а- и Ь-клеток; характерны для начальных стадий инфекции и фазы замедленного роста.

Размножение

Риккетсии размножаются, подобно бактериям, простым поперечным делени­ем; выделяют 2 типа деления: 1) обычное деление кокковидных а- и b-форм с образованием гомогенных популяции; 2) размножение мицелия дроблением нитевидных d-форм с последующим образованием популяции, состоящих из клеток а- и b-типов.

Культуральные свойства

Патогенным риккетсиям свойственен внутриклеточный паразитизм; они не способны размножаться на бесклеточных средах и мертвых субстратах. Для жизнедеятельности оптимален пониженный метаболизм зараженных клеток, поэтому сроки максимального накопления отодвигаются до 7-12 суток. Для культивирования пригодны куриные эмбрионы, фибробласты куриных эмбрионов и некоторые стационарные ли­нии клеток млекопитающих (например, клетки МсСоу); нестабильны при отделении от компо­нентов клеток хозяина (могут сохранять стабильность в средах с белками снятого молока или альбуминами сыворотки, в растворах с сахарозой, глутаматом и К₃РО₄). Температурный оптимум 32-35°С; рост угнетается при 40°С; погибают при 56°С.

Токсинообразование. Патогенные риккетсии образуют токсические вещества, играющие важную роль в патогенезе риккетсиозов. От бактериальных экзотоксинов их отличает неотделимость от микробных клеток и их чрезвычайная неустойчивость (поэтому о токсическом действии судят по влиянию живых культур). Они не тождественны эндотоксинам, т.к. термолабильны (белки), неустойчивы к действию формалина. Всем патогенным видам присущи гемолитические свойства в отношении эритроцитов различных животных.

Устойчивость. Для подавляющего большинства видов характерна низкая устойчивость во внешней среде; они плохо переносят повышение температуры до 50-70°С (исключая Coxiella bumetii), но хорошо консервируются при температуре -20-70°С; неустойчивы к действию дезинфектантов и антисептиков (исключая Coxiella bumetii). Выживаемость в жидких сре­дах зависит от их состава, рН и температуры; лучше сохраняются в белковых средах с нейтральной или слабо щелочной рН, например при 4°С С. bumetii сохраняется в молоке до 2 месяцев. В высушенном состоянии сохраняются гораздо дольше — на различных субстратах (овчина, фекалии вшей) до 1-3 лет; лиофилизация обеспечивает неопределенно долгое со­хранение. Активность подавляют антибиотики тетрациклинового ряда, но они резистентны к сульфаниламидам и некоторым антибиотикам.

Патогенез всех риккетсиозов (исключая Q-лихорадку) носит черты несомненного сходства.

После проникновения в организм (с укусом членистоногого-переносчика или заноса инфицированных фекалий в место укуса, например, при расчесывании) возбудитель активно размножается в эндотелии прилегающих капилляров; эта стадия раннего размножения составляет инкубационный период заболевания длительностью 7-10 суток.

В течение нескольких первых суток инкубационного периода в месте укуса развивается реакция ГЗТ, иногда сопровождаемая лимфаденопатией. Первоначально риккетсии размножаются в месте первичного очага, затем диссеминируют по лимфотоку; до развития иммунных реакции основной барьер для возбудителя — фагоциты (преимущественно макрофаги), поглощающие их спонтанно. Однако неопсонизированные риккетсии способны выживать и размножаться в их цитоплазме, т.к. синтезируют фосфолипазы, разрушающие фагосомы; следствие этого — воспалительные реакции в лимфатических узлах, индуцируемые макрофагами.

Через 7-10 суток возбудитель диссеминирует гематогенно; активное размножение риккетсий в ядрах и цитоплазме эндотелиальных клеток вызывает васкулиты с образованием периваскулярных мононуклеарных инфильтратов. Пораженные клетки содержат риккетсии в виде телец-включений (тельца включений, или клетки Музера); при этом риккетсии Провацека чаще расположены в цитоплазме, а риккетсии Риккетса — в ядрах зараженных клеток.

По мере диссеминирования возбудителя поражения сосудов принимают генерализованный характер, что обусловливает клинические проявления — на коже появляется пятнистопапулезная сыпь, в сосудах отмечают диссеминированный тромбоз с развитием ишемии и некротичес­ких изменений в периваскулярных тканях. Генерализованное поражение эндотелия приводит к повышению проницаемости сосудов, появлению отеков и геморрагий с развитием гипотензивного шока; повреждение эндотелиоцитов активирует свертывающую систему крови с возможным формированием синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания. Смерть пациентов обусловливают острая сердечная недостаточность (основная причина), поражения ЦНС либо расстройства кровообращения, опосредованно приводящие к сердечной недостаточности.