Питательные среды для культивирования клостридий

Среда Китта-Тароцци. Мясо или печень крупного рогатого ско­та нарезают мелкими кусочками, заливают трехкратным объемом МПБ или бульона Хоттингера (рН 7,4—7,6) и 30 минут кипятят. Затем среду фильтруют, печень (мясо) промывают водопроводной водой, подсушивают фильтровальной бумагой. По 3—4 кусочка мяса (пече­ни) помещают в пробирку, наливают 7—8 мл бульона, покрывают сло­ем вазелинового масла и стерилизуют при 120°С 20 минут. Перед ис­пользованием среду регенерируют (кипятят с последующим охлажде­нием).

Кровяной агар с глюкозой. К 3%-ному МПА (рН 7,2—7,4), расп­лавленному и охлажденному до 50°С, добавляют до 1—2% стериль­ного раствора глюкозы, 15—20% свежей дефибринированной крови ба­рана или лошади. Разливают по чашкам Петри, подсушивают 20—30 минут в термостате. Культивирование проводят в анаэростате.

Полужидкий агар для строгих анаэробов (Тароцци). В бульон Мартена (рН 7,2-7,4) с 0,3-0,5% глюкозы добавляют 0,1% агара. Среду разливают по 9 мл в стерильные пробирки с кусочками варе­ного мяса, печени или фарша, стерилизуют при 120°С 30 минут. Сре­ду можно использовать, не заливая поверхность вазелиновым маслом.

Агар для трубок Виньял-Вейона. В бульоне Мартена (рН 7,4) раст­воряют 2% агара, 0,1% глюкозы. Среду разливают в узкие тонкостен­ные пробирки и стерилизуют дробно, текучим паром в течение 3 дней.

Бульон Вейнберга для анаэробов. 1 кг бычьего сердца пропуска­ют через мясорубку, добавляют к фаршу 1 л воды, нагревают до ки­пения, охлаждают, снимают жир. Смешивают 400 г печени, 400 г сви­ных желудков, 40 г соляной кислоты, 4 л воды, подогретой до 50°С, и выдерживают при этой температуре 18-24 ч. Затем подогревают до 100°С, жидкость сливают, фильтруют, добавляют 0,2% двуоснов­ного фосфорнокислого натрия и устанавливают рН 7,4. Смешивают 1 л мясной воды из сердца быка и 2 л полученного пептона, устанав­ливают рН 7,8—8,2 и стерилизуют при 120°С 30 минут. Бульон разли­вают по пробиркам с кусочками вареной печени, наливают стериль­ное вазелиновое масло слоем 0,5 см и вновь стерилизуют при 120° С 30 минут. Перед посевом к бульону добавляют стерильный раствор глю­козы до 0,5%.

Среда Виллиса и Хоббе. Смешивают 400 мл бульона Хоттингера, 4,8 г агара, 4,8 г лактозы, 1,3 мл 1%-ного раствора нейтрального крас­ного. Стерилизуют при 115°С 15 минут, охлаждают до 50°С и добавля­ют 15 мл стерильной желточной суспензии (смешивают поровну ку­риный желток и физиологический раствор) и 60 мл стерильного обез­жиренного молока.

Железо-сульфитный агар (Вильсон, Блер, 1924). К 100 мл 3%-ного МПА (рН 7,4) с 1% глюкозы при температуре 60°С добавляют 10 мл 20%-ного раствора сернокислого натрия (Na₂SO₃) и 1 мл 8%-ного раствора хлористого железа (FeCl₃), приготовленного на сте­рильной дистиллированной воде. Раствор Na₂SO₃ предварительно сте­рилизуют 1 ч текучим паром. Затем среду, не стерилизуя, разливают по чашкам Петри. Сернистокислый натрий можно заменить серноватистокислым натрием (Na₂S₂O₃), а хлористое железо—сернокислым (FeSO₄). При восстановлении Na₂SO₃ сульфат натрия соединяется с хлорным железом и образуется черный осадок сернистого железа (FeS). Этой способностью обладают анаэробы и некоторые аэробные бактерии, вследствие чего колонии таких микроорганизмов окраши­ваются в черный цвет. С. perfringens, обладающий большой скоростью роста, изменяет цвет среды через 1-2 ч культивирования. Другие анаэ­робы формируют зеленовато-черные колонии через 6-7 ч.

Железо-сульфитное молоко (Робинзон, Стоваль, 1937). К 100 мл обезжиренного молока добавляют 10 мл 20%-ного раствора сернистокислого натрия и 1 мл 8%-ного хлористого железа. Среду готовят непосредственно перед использованием и разливают по пробиркам. На данной среде С. perfringens можно обнаружить в смеси со стрепто­кокками, которые на других средах способны заметно тормозить его рост.

Бензидино-кровяной агар (Гордон, Мак Леод, 1940). К 3%-ному МПА (рН 6,4) с 1% глюкозы, подогретому до температуры 50°С, добавляют бензидин до концентрации 9% и 10% стерильной дефиб­ринированной крови барана. Компоненты перемешивают до приобре­тения средой шоколадного оттенка, разливают по чашкам Петри и подсушивают 4-5 ч в термостате. Засеянные чашки выдерживают в анаэробных условиях в термостате 12-24 ч, а затем переносят в аэроб­ные условия. Колонии С. novyi окрашиваются в черный цвет за 15-30 минут. Раствор бензидина готовят следующим образом: к 50 мл дистил­лированной воды добавляют 0,25 г основного бензидина, 0,3 мл 1% HCl и нагревают до растворения. Раствор пригоден для употребления в течение 2 недель.

Желточно-кровяной агар (Шапина-Вегина, 1962). К 2,5%-ному МПА добавляют 10% дефибринированной крови барана, 10% желточ­ной взвеси. Среда предназначена для выявления С. novyi. Через 16 ч выращивания колонии окружены непрозрачной зоной гемолиза с на­личием на поверхности среды вокруг колоний непрозрачной пленки с жемчужным блеском. Другие бактерии (аэробы, анаэробы), как правило, не дают одновременно перламутрового слоя и зоны редукции.

Полусинтетическая среда (Bonnel, Burgian, Raby, 1959). Исполь­зуют для культивирования и быстрой селекции анаэробных бактерий. В 1000 мл дистиллированной воды растворяют 15 г пептона, 5 г дрож­жевого экстракта, 2,5 г натрия хлорида, 1,3 г агар-агара и подщелачи­вают Na₂CO₃. Смесь автоклавируют при 120° С в течение 15 минут, фильт­руют и добавляют 5,5 г глюкозы, 0,5 г гидросульфита натрия (пред­варительно растворенные в небольшом количестве воды), устанавли­вают рН 7,1. Добавляют 0,001 г резазурина и встряхивают смесь в те­чение нескольких минут. Среду разливают в пробирки по 15 мл, сте­рилизуют при 110°С 30 минут, охлаждают под холодной водой. При росте анаэробов среда окрашивается в нижней части пробирки, факуль­тативных анаэробов — весь столбик среды. Среду используют 3 недели при хранении в условиях комнатной тем­пературы.

Перфрингенс-агар (O.P.S.P.-агар, пропись фирмы «Дифко», 1982). В 1000 мл дистиллированной воды растворяют 15 г триптона, 5 г дрож­жевого экстракта, 5 г соевого пептона, 7 г печеночного экстракта, 1 г железа аммонийно-цитратного, 1 г натрия метабисульфита, 1,5 г трис-буфера, 10 г агара, устанавливают рН 7,3. Стерилизуют автоклавированием при 121 С 15 минут, затем охлаждают до 50°С, вносят до­бавки (стерильно), обеспечивающие среде селективные свойства, и разливают по чашкам Петри. Добавка «А» содержит 100 мл натрия судьфадиазина, добавка «В» — 0,5 г олеандомицина фосфата и 10000 ЕД полимиксина В сульфата. Среда состоит из 100 мкг/мл натрия сульфадиазина, 0,5 мкг/мл олеандомицина фосфата и 10 ЕД полимиксина В сульфата. Данный состав обеспечивает селективные свойства, опти­мальные для изоляции С. perfringens.

Натрия метабисульфат и железо аммонийно-цитратное являются индикаторами редукции сульфита, что влияет на формирование ко­лоний возбудителя черного цвета диаметром 2-4 мм. Рост других сульфатредуцирующих бактерий (сальмонеллы, протей, цитробактер, ста­филококки, бациллы) ингибируется. На среде могут расти энтерокок­ки, но их колонии по внешнему виду отличаются от колоний С. perfringens.

Анаэробный агар Шадпера (пропись фирмы «Дифко», 1982). В 1000 мл дистиллированной воды растворяют 10 г триптического соевого бульона, 5 г пептона, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г декст­розы, 0,4 г цистеина гидрохлорида, 0,01 г гемина, 0,75 г трис-буфера, 13,5 г агара. Устанавливают рН 7,6, стерилизуют автоклавированием при 121°С 15 минут.

С селективными добавками среду используют для выделения клостридий, бактероидов, флавобактерий, лактобацилл, стрептококков (ана­эробных) из проб фекалий и кишечного тракта.

Для изоляции клостридий и бактероидов к 1000 мл основного анаэробного агара добавляют 10 г порошка плаценты и 0,002 г неомицина. С целью выделения флавобактерий в 1000 м³ вносят 7 мл 0,5%-ного тиротрицина в этаноле. Для анаэробных лактобацилл и стрепто­кокков в 1000 мл вносят 10 г натрия хлорида и 0,002 г неомицина. Посевы инкубируют при 37°С в анаэробных условиях.

Основной перфрингенс-агар (пропись фирмы «Дифко», 1982). Среда используется для изготовления TSC- или SFP-агара при предва­рительной идентификации и подсчете С. perfringens.

В 1000 мл дистиллированной воды растворяют триптозы—15 г, соевого пептона — 5 г, мясного экстракта (сухого) — 5 г, дрожжево­го экстракта — 5 г, натрия метабисульфита — 1 г, железа аммонийно-цитратного — 1 г, агара — 14 г. Устанавливают рН 7,6, стерилизуют при 121°С 10 минут. Затем среду охлаждают до 50°С и вносят соот­ветствующие селективные добавки.

Триптозо-сульфитный циклосериновый агар (TSC-агар). В основ­ной перфрингенс-агар вносят D-циклосерин из расчета 400 мг/л и 50 мл/л желточной эмульсии. Компоненты перемешивают и готовую среду разливают в чашки Петри.

Перфрингенс-агар Шахиди—Фергусона (SFP-агар, пропись фирмы «Дифко», 1982). В основной перфрингенс-агар вносят следующие анти­биотики: 12 мг/л канамицин-сульфат, 30000 ЕД/л полимиксин В сульфа­та и 50 мл/л желточной эмульсии. Готовую среду разливают в чашки Пет­ри. На обеих указанных средах вокруг черных колоний С. perfringens образуется опалесцирующая зона, указывающая на лецитиназную ак­тивность микроорганизма.

Анаэробный бульон Шадлера (пропись фирмы «Дифко», 1982). По составу среда аналогична анаэробному агару Шадлера, но из нее исключен агар. Используют для выращивания патогенных анаэробов, для определения антибиотикоустойчивости анаэробов методом разве­дений с выражением результата в виде МИК.

Тиогликолевый бульон (пропись фирмы «Дифко», 1982). В 1000 мл дистиллированной воды растворяют 0,5 г L-цистина, 2,5 г натрия хлорида, 5,5 г декстрозы, 5 г дрожжевого экстракта, 15 г пан­креатического перевара казеина, 0,5 г натрия тиогликолята. Устанав­ливают рН 7,1, разливают по емкостям и стерилизуют при 121°С 15 минут. Перед использованием среду кипятят и охлаждают.

Рекомендуется для контроля на контаминацию различных мате­риалов анаэробными бактериями.

Анаэробный агар Уилкинс-Чангрена (пропись фирмы «Дифко», 1982). В 1000 мл дистиллированной воды растворяют 10 г трипто­на, 10 г желатинового пептона, 5 г дрожжевого экстракта, 1 г декст­розы, 5 г натрия хлорида, 1 г L-аргинина, 1 г натрия пирувата, 0,0005 г менадиона, 0,005 г гемина, 10 г агара. Устанавливают рН 7,1, стерили­зуют при 121°С 15 минут.

Среда рекомендуется для изоляции анаэробных микроорганиз­мов из клинических материалов, является стандартной для опреде­ления анткбиотикочувствительности анаэробных бактерий. При иск­лючении агара среда может быть использована как питательный бульон.

Обогащенный клостридиальный агар (RCM-агар, пропись фирмы «Дифко», 1982). В 1000 мл дистиллированной воды растворяют 3 г дрожжевого экстракта, 10 г мясного экстракта, 10 г пептона, 5 г декст­розы, 1 г растворимого крахмала, 5 г натрия хлорида, 3 г натрия аце­тата, 0,5 г цистеина гидрохлорида, 15 г агара. Устанавливают рН 6,8, стерилизуют при 121°С 15 минут.

Среда рекомендуется для исследования кишечной микрофлоры. Perry et al. (1955) использовали ее для изучения рубцовых стрепто­кокков, Bornes, Goldberg (1962), внеся в состав хлортетрациклина гидрохлорид или натрия азид, применяли среду для исследования фецес кур. С добавками крови она пригодна для обнаружения в фецес животных и людей лактобацилл, с добавками крови и неомицина — бактероидов.