Среды для дальнейшей дифференциации

Цитратный агар Симонса [Simmons J-, 1926]

Цитратная среда Симонса предназначена для дифференциации энтеробактерий по их способности использовать натрия цитрат в качестве единственного источника углерода. Она представляет собой модификацию жидкой синтетической среды Коser (1923), заключающуюся в добавлении агара и индикатора рН.

Принцип действия: бактерии, обладающие соответствующими энзимами (цитратазой и др.), способны развиваться,. используя в качестве единственного источника углерода входящий в среду цитрат. Имеющиеся в среде ионы магния способствуют действию энзимов. В реакции расщепления цитрата одним из конечных продуктов является двуокись углерода (СО₂), вступающая далее во взаимодействие с ионами натрия и водой, в результате чего образуется натрий карбонат (Na₂СО₃) — вещество, сдвигающее рН среды в щелочную сторону. Щелочению способствует и аммиак (NH₃), образующийся в среде при расщеплении солей аммония, вводимых в среду как источник азота.

В результате указанных метаболических реакций вегетирующие бактерии изменяют оливковый цвет среды на ярко-синий. Энтеробактерии, не обладающие способностью утилизировать цитрат в качестве единственного источника углерода, на среде Симонса не растут, цвет среды остается без изменения.

Состав: Натрий хлорид (NaCl) —5 г

Магний сульфат (MgS04-7H2O) —0,2 г

Аммоний дигидрофосфат (NH4H2PO4) — 1 г

Калий гидрофосфат (К2НРО4) — 1 г

Натгя[й_цитрат (CgllsOrNa;, • 5Н2О) —3 г

!Громтим6ловый синий —0,08 г

Агар (тщательно промытый) —20 г

Вода дистиллированная — 1000 мл

Примечание. Аммоний дигидрофосфат может быть заме­нен на аммоний гидрофосфат— (NH4)jHP04 или на натрий-ам­моний гидрофосфат (ЫаКЬЦНРСЬ), взятые по 1,5 г на 1 л сре­ды. Калий гидрофосфат можегг быть заменен тем же количест­вом калия дигндрофосфата (KHjPO,,).

Приготовление: предварительно тщательно отмытый,-агар расплавляют при подогревании в свежеприготовленной дистиллированной воде. Все соли сначала растворяют в неболь­шом объеме воды, затем раствор добавляют к расплавленному агару и доводят до 1000 мл. Устанавливают рН 7,2, добавляют индикатор в виде 0,2% водного раствора в объеме 40 мл, хоро­шо перемешивают и разливают в пробирки по 5—7 мл. Стери­лизуют при 121 °С 15 мин или при 112 °С 30 мин. При охлажде­нии скашивают, оставляя столбик 2—2'/а см.

Ацетатный агар [Trabulsi L., Ewing W., 1962]

Ацетатный агар предназначен в основном для дифференциа­ции шигелл п эшсрихий, а также некоторых сальмонелл, на­пример S, paratyphi В (ацетат —) и S. Java (ацетат +).

Принцип действия тот же, что указан для цитратной среды Симонса. В качестве дифференцирующего субстрата вве­ден натрия ацетат. Бактерии, способные использовать ацетат в качестве единственного источника углерода, в процессе мета­болизма подщелачивают среду, окрашивая ее в синий цвет.

Состав: Натрий хлорид (NaCl) —5г

Магний сульфат (MgS04-7H2O) —0,2 г
Аммоний дигидрофосфат (NH4H2P04) — 1 г

Калий гидрофосфат (КаНРО4) — I г

Нат^ий_адёт_а1ДНаСзНзр2) —2 г

Агар (тщательно отмытый) —20 г

Бромтимоловый синий —0,08 г

Вода дистиллированная — 1000 мл

Приготовление: в свежеприготовленной дистиллирован­ной воде при подогревании расплавляют агар, добавляют пред-

варительно растворенные соли, устанавливают рН 7,2, фильт­руют через ватномарлевый фильтр, добавляют 40 мл индика­тора (в виде 0,2% водного раствора), хорошо перемешивают и разливают в маленькие (агглютинационные) пробирки по 3— 4 мл. Стерилизуют при 112°С 15 мин, скашивают. Ватные проб­ки асептически заменяют на стерильные корковые, Го юная сре­да зеленовато-оливкового цвета. Ацетатный агар при 4 "С мож­но хранить до 2 мсс.

Ацетатный агар (сухой)

Ацетатный агар, выпускаемый в сухом виде, имеет принцип действия, указанный для плотной агаровой среды.

Состав и способ приготовления сухой среды указаны на эти­кетке.

Среда с алгинатом.[Davis В. R,, Ewing W., 1964]

Диагностическая среда с натрия алгинатом предназначена для дифференциации бактерий внутри родов Klebsiella и Ente-robacteju. а также представителей некоторых других родов.

Принцип действия: основан на способности ряда бак­терий усваивать натрия алгинат в качестве единственного ис­точника углерода.

Состав: в среду входят те же ингредиенты, что и в цитрат-пый агар Симонса, по вместо натрия цитрата добавляют 2,5 г натрия алгината.

Приготовление среды, как указано для агара Симонса.

Цитратный агар Кристенсена [Christensen W., 1949] в модификации Центрального НИИ вакцин и сывороток, им. Мечникова

Среда предназначена в основном для дифференциации ши­гелл и эшерихий; может способствовать дифференциации S. gal-linarum (цитрат +) и S. pullorum (цитрат —).

Принцип действия: основан на способности некоторых бактерий утилизировать натрия цитрат в присутствии органиче­ских субстратов, образуя щелочные продукты. Другие бактерии (например, шигеллы) этой способностью не обладают. Цнстеин (источник азота), дрожжевой экстракт и глюкоза обеспечива­ют питательные ресурсы, достаточные для роста всех энтсробак-терий. Готовая среда имеет желтый цвет (индикатор рП фено­ловый красный).

При росте бактерий, не способных расщеплять цитрат п в. Этих условиях, цвет среды не изменяется. При положительной реакции рП смещается в сторону щелочения и агар окрашива­ется в розовый или краснмй цвет (в зависимости от интенсив­ности реакции).

'Состав: Натрий цитрат, нейтральный (ЫазС6Н5О7-5НаО)

Глюкоза

Дрожжевой экстракт жидкий

или Сухой

Цистеин гвдрохлорид
Калий дигидрофосфат.
Натрий хлорид (NaCl)
Феноловый красный (0,4% водный
раствор) —3 мл

Агар — 15 г

Вода дистиллированная — 1000 мл

Приготовление: предварительно все ингредиенты рас­творяют в небольших объемах воды, затем все соединяют, до-•бавив недостающее количество воды, хорошо перемешивают, присоединяют агар. Смесь нагревают до полного растворения агара, фильтруют через полотняную ткань — балтинг, устанав­ливают рН, который в готовой среде должен быть 6,7 и добав­ляют индикатор. Разливают по 5 мл в стерильные пробирки. Стерилизуют при 112°С 30 мин или при 121 °С 15 мин. Охлаж­дают в полускошенной позиции, оставляя столбик высотой -2см.

Приготовление дрожжевого экстракта:

'Состав: Дрожжи прессованные хлебные (луч­
ше маточные) —0,5 кг
Вода дистиллированная — 1000 мл

Дрожжевой экстракт изготовляют двумя способами:

1. Дрожжи измельчают и кипятят на слабом огне I ч, вновь
размешивают, разливают во флаконы, стерилизуют при 121 °С
30 мин. Готовый экстракт помещают в холодильник на 5—
7 дней. Для приготовления сред используют надосадочную жид­
кость. Консервируют добавлением 0,5% хлороформа. Консерви­
рованный экстракт можно хранить при 4—10 °С несколько ме­
сяцев.

2. В 1 л дистиллированной воды разводят 0,5 кг хлебных
дрожжей, кипятят в течение 1 ч (сохраняя первоначальный
объем добавлением воды); фильтруют через полотняный фильтр.
Консервируют 1% хлороформа, хранят несколько месяцев.

Цитратный агар Кристенсена (сухой)

Цитратный агар Кристенсена, выпускаемый в сухом виде, имеет принцип действия, указанный для жидкой агаровой среды.

Состав и способ приготовления сухой среды указаны на эти­кетке.

с малонатом [Leifson E., 1938] в модификации W. Ewingc соавт. (1957)

Среда с малонатом предназначена для дифференциации эн-теробактерий, в том числе S. arizonae, от других сальмонелл.

Принцип действия: дифференциация основана на спо­собности некоторых энтсробактерий расщеплять малонат натрия с образованием щелочных продуктов. Присутствие в среде глю­козы и дрожжевого экстракта обеспечивает развитие в бульоне всех энтеробактерий. При этом бактерии, ферментируя глюкозу, образуют кислоту (рН<6,0) и среда из бледно-оливковой ста­новится желтоватой (индикатор бромтимоловый синий). Однако позднее, через 24—48 ч бактерии, способные расщеплять мало­нат натрия, вызывают изменение рН в сторону щелочения (рН>7,6) и среда приобретает ярко-синий цвет. Механизм ути­лизации малоната натрия изучен еще недостаточно.

Состав: Дрожжевой экстракт жидкий —30 мл

или

Сухой — 1 г

Аммоний сульфат [(NH^bSO*] —2 г

Калий дигидрофосфат (КН2РО\) —0,4 г
Калий гндрофосфат (КаНРО4) —0,6 г

Натрий хлорид (NaCl) —2 г

Натрий малонат (CH2COOHCOONa) — Зг
Глюкоза —0,25 г

Бромтимоловый синий (0,2% водный
раствор) — 12 мл

Вода дистиллированная — 1000 мл

Приготовление: в кипящей воде растворяют ингредиен­ты в указанной последовательности. После добавления каждого реактива среду следует доводить до кипения. Затем фильтруют, доводят до первоначального объема, охлаждают и устанавлива­ют рН 6,7, добавляют индикатор, разливают в серологические пробирки по 2 мл, стерилизуют при 112°С 30 мин или при J21 °С 15 мин.

Готовая среда имеет бледно-оливковый цвет.

Агар с фенилаланином в модификации W. Ewing et al. (1957)

Среда предназначена для дифференциации бактерий рода Proteus, включая P. inconstans (Providencia), от других энтсро­бактерий.

Принцип действия: основан на способности бактерий рода Proteus расщеплять с помощью фермента фенплалапин-дезаминазы (флавопротеипа) аминокислоту фенилаланин. В ре­зультате реакции образуются конечные продукты — фенилшгро-виноградная кислота и аммиак. Кислота эта бесцветна и для ее обнаружения применяют тест-реактив, содержащий хлорид

железа (III), который присоединяется к фенилппровинограднои кислоте, вызывая зеленое окрашивание.

Состав: Дрожжевой экстракт жидкий — 100 ыл

или

• Сухой — 3 г

Натрий хлорид (NaCl) —5 г
Натрий гидрофосфат (Na2HP04) —1 г

L-Фенилаланин — 1 г

или

DL-Фснилаланин — 2 г

Агар — 12 г

Вода дистиллированная — 1000 мл

Приготовление: дрожжевой экстракт вносят а холод­ную воду, после чего ее нагревают. Затем последовательно до­бавляют остальные ингредиенты и кипятят до полного расплав­ления агара (5—10 мин), фильтруют через ватно-марлевып фильтр и разливают по 2—3 мл в агглютипационные пробирки. Без подтитровки реакция среды должна иметь рН 7,0—7,2.

Стерилизуют при 112°С 30 мин и охлаждают в скошенном положении.

Готовая среда не окрашена.

Тест-реактив: готовят 10% водный раствор железа(Ш) хло­рид— рсСЦ. Храпят при 4—6 "С, без доступа света.

Бульон с фенилаланином и малонатом [Shaw С., Clarke Ph., 1955]

Комбинированная среда для дифференциации бактерий по их способности утилизировать фенилаланин и малонат натрия.

Принцип действия: тот же, что описан для сред, со­держащих отдельно указанные субстраты, входящие в комбини­рованную среду.

В этой среде учет реакций производят последовательно: сначала учитывают расщепление малопата (при положительной реакции среда становится синей, при отрицательной цвет не ме­няется). Затем для учета расщепления фенилаланнна среду подкисляют прибавлением 3—5 капель 0,1 N раствора НС1 до пожелтения среды. Далее в пробирку добавляют 3—.4 капли тест-реактива (10% водного раствора FeCl3). При положитель­ной реакции на фенилаланиндсзаминазу среда через 2—3 мин становится зеленой.

Состав: Дрожжевой экстракт жидкий —30 мл

или

Экстракт сухой — 1 г

Натрий малонат —3 г

L-Фенилаланин —1 г

или
DL-Фенилалании —2 г

Аммоний сульфат [ (NH4)S04] —2 г

Калий дигидрофосфат (КН2РО4) —0,4 г

Калий гидрофосфат (К2НРО4) —0,6 г

Натрий хлорид (NaCl) —2 г

Бромтимоловый синий (0,2% водный —12мл

раствор)

Вода дистиллированная — 1000 мл

Приготовление: все указанные ингредиенты последова­тельно растворяют в кипящей воде, охлаждают, устанавлива-wt рН, добавляют индикатор, разливают в пробирки, стерили­зуют при 115°С 10 мин. Конечное значение рН в среде должно 'Сыть 6,3. Готовая среда бледно-зеленого цвета.

Среда с мочевиной Кристенсена [Christenscn \V., 1946]

Это дифференцирующая среда, предназначенная для выяв­ления у энтеробактсрий фермента уреазы.

Принцип действия: бактерии, обладающие ферментом уреазой, способны производить гидролиз мочевины, образуя в виде конечных продуктов аммиак и углекислоту, тем самым из­меняя рН среды в щелочную сторону. Среда из желтоватой становится красной в срок от нескольких часов до 4 сут (инди­катор феноловый красный).

Состав: Пептон — 1 г

Натрий хлорид (NaCl) —5 г

Калий дигидрофосфат (КН2РО4) —2 г

Агар. — 20 г

Глюкоза -г-1 г

Феноловый красный (0,2% раствор) —6мл

Мочевина (20% водный раствор)* —100 мл

Вода дистиллированная — 1000 мл

Приготовление: пептон, соли и агар растворяют при на­гревании, устанавливают рН, фильтруют, стерилизуют при 115СС 20 мин. Затем добавляют глюкозу и индикатор, стерили­зуют текучим паром.1 ч, охлаждают до 50—55 "С. Раствор мо­чевины после стерилизующей фильтрации асептически добав­ляют к основе. Готовую среду асептически разливают в сте­рильные пробирки и охлаждают в скошенном положении.

Жидкая среда с мочевиной (модификация среды Кристенсена)

— 1 г — 5г

Состав: Пептон

Натрий хлорид (NaCl)

* Применение 50% водного раствора мочевины (40 мл на 1 л среды), предварительно выдержанного 2—3 суток для «самостернлизации», исключает необходимость его фильтрации.

Калий дигидрофосфат (КН₂РО₄) — 2 г
Глюкоза — 1 г

Мочевина (50% водный раствор) —40мл
Феноловый красный (0,2% водный
раствор) — 6 мл

Вода дистиллированная до 1000 мл

Приготовление: к воде добавляют пептон, соли и кипя­тят 2—3 мин, вносят глюкозу. Устанавливают реакцию среды рН 6,8—6,9 (особо точно), добавляют индикатор, фильтруют через бумажный фильтр, разливают во флаконы по 150—200 мл (мерно) и стерилизуют при 115 "С 30 мин. Асептически добав­ляют мочевину (50% водный раствор, выдержанный 2—3 сут для «самостерилизации») из расчета конечного содержания мо­чевины в среде 2%. Разливают в стерильные пробирки асепти­чески.

1 Среда с мочевиной Преуса.[Н. Preus, цит. по Г. Дрегеру, 1957] в модификации Центрального НИИ вакцин и сыворо­ток им. Мечникова

Назначение среды и принцип действия те же, что указаны для среды с мочевиной Кристенссна. Бактерии, обладающие эн­зимом уреазой, расщепляя мочевину, подщелачивают среду, ко­торая из оливковой становится синей (индикатор рЫ бромтимо-ловый синий). Другие бактерии, уреазоотрицательные, сбражи­вая глюкозу, сдвигают рН в кислую сторону и среда стано­вится желтой. Учет результатов через 24 и 48 ч.

Состав: Бульон Хоттингера — 1000 мл

Агар —15 г

Глюкоза — 5 г

Мочевина (50% водный раствор) —20 мл Бромтимоловый синий (0,2% водный—12мл раствор)

Приготовление: агар расплавляют в бульоне при подо­гревании, фильтруют, устанавливают рН 6,9—7,0. Стерилизуют при 121 "С 20 мин. К стерильному питательному агару добав­ляют глюкозу, мочевину, индикатор. Стерилизуют текучим паром однократно 15 мин, после чего скашивают. Цвет готовой среды оливковый.

Среда Кларка [Clark W., Lubs H., 1915]

Среда Кларка представляет собой буферированный глюкозо-пептонный бульон, используемый для выращивания бактерий при постановке реакций с метиловым красным (MR-тест) и Фо-геса — Проскауэра (VP-тест). Культуру обычно выращивают при 37 или 22 °С в течение 2—5 сут.

Принцип действия. 1. В реакции с метиловым красным определяют степень ферментации глюкозы с образованием сме­си кислот (молочной, уксусной, муравьиной и др.), подкисляю­щих среду до рН 4,0—5,0. В этом случае реакция считается по­ложительной и бесцветная среда с выросшей культурой после добавления реактива станет ярко-красной. Если же кпслотооб-разование будет слабым и значение рН окажется около 6,0— 7,0, то среда станет желтой (реакция отрицательная).

2. В реакции Фогеса — Проскауэра определяют наличие аце­тоина (ацетилметилкарбинола), являющегося промежуточным продуктом при расщеплении глюкозы до бутилен-гликоля неко-торыми энтеробактериями, например клебсиеллами, гафниями и др. Для этой цели предпочтительно используют метод, кото­рый предложил М. Barritt (1936): к 4—5-суточной культуре до­бавляют сначала а-пафтол, затем раствор КОН, ц пробирку хорошо встряхивают для лучшего доступа кислорода. Указан­ный порядок добавления реактивов обязателен. Происходит ре­акция окисления ацетоина в присутствии щелочи и а-нафтола (как катализатора), что приводит к образованию диацетила. Диацетил рассматривают как основной реагент, дающий цве~т-~ ную реакцию с пептоном и,К_ОЦ>. Установлено, что без аргини­на и других азотных соединений, входящих в пептон, красный цвет не возникает [Mac Faddin J., 1976].

Интенсивность появляющегося в верхней части среды красно­го окрашивания (при положительной реакции) зависит от ко­личества ацетоина в испытуемой культуре и правильности по­становки реакции.

Состав: Пептон — 5 г

Калий гидрофосфат (КаНР0₄) —5 г

Глюкоза —5 г

Вода дистиллированная — 1000 мл.

Приготовление: ингредиенты растворяют в воде, кипя­тят 2—3 мин, фильтруют через бумажный фильтр, устанавли­вают рН 6,9—7,0, разливают в пробирки. Стерилизуют при 112 °С 20 мин или 3 дня текучим паром по 20 мин.

Тест-реактивы

А. Для реакции с метиловым красным

Состав: Метиловый красный —0,1 г

Спирт этиловый 96° —300 мл

Вода дистиллированная —200 мл

Приготовление: краску растворяют в спирте, затем до­бавляют воду до 500 мл.

Примечание. К 2 мл испытуемой культуры добавляют 5—6 капель тест-раствора.

Б. Дл я реакции Фогеса — Проскауэра

: 1) а-нафтол

Спирт этиловый 96°

I 2) Калий гидро-

Окись (КОН)

^ Вода дистилли-

Рованная

Применение. К 2,5 мл культуры добавляют 1 мл рас­твора а-нафтола, затем 0,4 мл 40% КОН.

Полужидкая среда для реакций с метиловым красным и Фогеса—Проскауэра i[Серов Г. Д., 1977]

Среда сконструирована на основе буферированного глюкозо-пептонного бульона Кларка и предназначена для определения в одной пробирке реакций с метиловым красным и Фогеса — Проскауэра, а т'акжс газообразования и подвижности.

Принцип действия: указан ранее (см. «Среда Клар­ка»). Добавленный в среду Кларка агар позволяет сокращать срок выращивания испытуемых культур и, кроме того, опреде­лять образование газа из глюкозы и подвижность бактерий.