Для дифференциации энтеробактерий от представителей других семейств

Среда для теста наLeifson Е., 1953)

окисление — ферментацию [Hugh R.,

Среда предназначена для установления путей расщепления углеводов бактериями (OF-тсст), что характеризует определен­ные семейства; у энтеробактерий расщепление углеводов проис­ходит ферментацией, у псевдомонад —окислением. Кроме того, существуют бактерии, у которых метаболизм углеводов пол­ностью отсутствует.

Принцип действия: процесс ферментации, требующий анаэробных условий, кратко изложен при описании принципа действия «Сред с углеводами». Окислительный же процесс рас­щепления углевода (глюкозы) начинается с прямого окисления его карбоксильной группы и протекает в присутствии атмосфер­ного кислорода.

Состав: Пептон —2 г

Натрий хлорид (NaCl) —5 г

Калий гидрофосфат (КаНРО,) —0,3 г

Агар — 3 г
Бромтимоловый синий (1% водный

раствор) — 3 мл

Глюкоза — 10 г

Вода дистиллированная — 1000 мл

Приготовление: среда требует особо тщательного при­готовления (аккуратного взвешивания, употребления хорошо проверенных ингредиентов и т. п.). Все вещества, входящие в состав.среды, растворяют при подогревании в водяной бане, фильтруют, разливают в пробирки по 5—6 мл и стерилизуют при 118°С 10 мин. Готовая среда имеет рН 7,1—7,2.

Используют и другой способ приготовления: основу (все ком­поненты, кроме глюкозы) готовят, как сказано выше, затем разливают в пробирки мерно по 5 мл и стерилизуют при 12ГС в течение 15 мин. Глюкозу в виде 10% водного раствора под­вергают стерилизующей фильтрации и добавляют асептически по 0,5 мл в каждую пробирку со стерильной основой. После тща­тельного перемешивания среду можно использовать. Допустимо хранение при 4 "С 2—3 дня.

Среда с KN0₃ для определения редукции нитратов

Это дифференциальная среда, предназначенная для под­тверждения принадлежности испытуемого штамма к энтеробак-териям, а также для дифференциации нейсссрий и некоторых других грамотрицательных бактерий.

Принцип действия: в микробиологии под восстановле­нием нитратов подразумевается способность микробов редуци­ровать соли азотной кислоты (нитраты) [МО_а~], например ка­лия нитрат, в соли азотистой кислоты (нитриты) [NOa~] с вы­делением аммиака (NO₃) или свободного азота (N₂) и других продуктов. Процесс этот осуществляется энтеробактерилмн с помощью фермента питратредуктазы и обычно протекает в анаэробных условиях, где микроорганизм извлекает необходи­мый кислород из нитратов. Наличие питратредуктазы устанав­ливают определением с помощью тест-реактива одного из про­дуктов расщепления нитратов — нитритов. Их определяют по красному окрашиванию среды после добавления тест-реактива, содержащего а-нафтиламин.

Состав: а) Оригинальная пропись:

,,..-" "Калий нитрат (KNO₃), свободный

от нитритов —0,2 г

Пептон — 5 г

Вода дистиллированная — 1000 мл

Приготовление: ингредиенты смешивают, устанавлива­ют рН 7,4, разливают в пробирки по 5 мл и стерилизуют при 121 ^SC 15 мин.

б) Модификация Центрального НИИ вакцин и.сывороток им. Мечни­кова:

Калий нитрат (KNO₃) —0,1 г

Пептонная вода (0,5% раствор) — 1000 мл
Натрий хлорид {NaCl). —2,5 г

Приготовление: Пептонную 1% воду разводят пополам дистиллированной водой, прибавляют натрий хлорид (до кон­центрации хлоридов 0,5%), вносят калия нитрат, все ингреди­енты растворяют и хорошо перемешивают, фильтруют через бу­мажный фильтр, устанавливают рН 7,1—7,2, разливают в про­бирки по 5 мл и стерилизуют при 112 "С 30 мин.

Примечание. Калий нитрат (КМО₃) должен быть свобо­ден от нитритов

Тест -реактивы

Состав: Раствор А.

— 8 г — 1000 мл — 5 г — 6 г — 1000 мл

Сульфониловая кислота Уксусная кислота (5N раствор) Раствор Б. а-Нафтиламин

или

Диметил-а-нафтиламип Уксусная кислота (5N раствор)

Приготовление растворов А и Б: соответствующие ингредиенты растворяют при слабом нагревании. Реактивы ток­сичны, требуют осторожного обращения. Хранить их необходи­мо в склянках темного стекла с притертыми пробками при 4 °С. Срок годности реагентов 2 — 3 мес (при периодическом контро­ле на известных тест-штаммах).

Тест-реактивы для определения цитохромоксидазы [Gaby W..+

Hadly С., 1957] в модификации W. Ewing, J. Johnson (1960)

Представители семейства Enterobacteriaceae не обладают ци-тохромоксидазной активностью, что служит для дифференциа­ции их от псевдомонад и некоторых других грамотрицательных бактерий.

Состав: Раствор А.

Спирт этиловый 95° — 100 мл

а-Нафтол — 1 г

Раствор Б.

Диметил-р-феннлсндиампн

гидрохлорид — 1 г

Вода дистиллированная — 100 мл

Примечание. Раствор А можно хранить в холодильнике до 10 дней, раствор Б — только один день.

Реактивы для окраски бактерий по Граму

Реактив 1 (для первичной окраски)

Состав: Генцианвиолет или кристалвиолет —1 г

Спирт этиловый 96° — 10 мл

Фенол —2 г

Вода дистиллированная — 100 мл

Приготовление: в ступке растирают краситель с фено­лом, постепенно добавляя спирт и воду. Тщательно перемешан­ную жидкость сливают во флакон, выдерживают сутки и затем фильтруют через бумажный фильтр.

По другому способу смешивают 10 мл насыщенного (4,8%) спиртового раствора красителя со 100 мл 2% феноловой воды.

Реактив 2. Раствор Люголя (в модификации Грама)

Состав: Калий йодид (KI) —2 г

Иод кристаллический — 1 г

Вода дистиллированная —300 мл

Приготовление: йод и калий йодид хорошо размешива­
ют в 10 мл воды, оставляют на сутки в мерной колбе, после чего
добавляют воду до 300 мл. •

Реактив 3. Спирт этиловый 96° — 100 мл
Реактив 4. Фуксин феноловый, разведенный

Состав: а) Фуксин основной —10 г

Спирт этиловый 96° — 100 мл

Ингредиенты смешивают и ставят в хорошо закрытом фла­коне в термостат на 18—20 ч.

б) Фенол —5 г

Вода дистиллированная — 100 мл

Приготовление: когда оба раствора будут готовы, до­бавляют 10 мл раствора фуксина к 100 мл фенолового раствора. При этом получается крепкий феноловый фуксин, который для работы разводят дистиллированной водой 1:10.

7. СРЕДЫ ДЛЯ ХРАНЕНИЯ И ПЕРЕСЫЛКИ КУЛЬТУР Яичная среда

Яичную среду используют для хранения и пересылки штам­мов.

Состав: Яйцо куриное (свежее, диетическое) —4 шт.
.. Натрий хлорид (0,9% стерильный
.. раствор) — 100 мл

Приготовление-: скорлупу яиц тщательно отмывают, об­рабатывают спиртовым раствором йода, затем спиртом и обжи­гают. Содержимое яиц сличают в банку с бусами и встряхива­ют до образования гомогенной массы, добавляют раствор нат­рия хлорида, тщательно перемешивают, разливают в стерильные пробирки по 4—5 мл и стерилизуют в скошешюм положении в аппарате Коха при 80 °С в течение 1 ч, два дня подряд.

Применение: бактериальную культуру засевают частым штрихом тю поверхности среды. Пробирки закрывают стериль­ными корковыми пробками и заливают парафином.

Полужидкий голодный агар [Крушинская Е. А., 1957|

Среда предназначена для хранения.культур.

Принцип действия: основан на том, что невысокое со­держание питательных веществ понижает жизнедеятельность бактерий, особенно в условиях хранения при 4—6 °С. Замедлен­ные процессы обмена веществ ограничивают скопления метабо­литов, что в свою очередь положительно влияет на сохранение исходных свойств штамма.

Состав: Бульон питательный, содержащий 0,6—0,9% общего азота, рН 7,2—

7,4, • • _ ЮОО мл

Агар —2—4 г

Приготовление: агар расплавляют в горячем бульоне, фильтруют, разливают по 8—10 мл в пробирки или по 1 мл в мелкие ампулы, стерилизуют при 121 °С 30 мин.

Применение: культуру засевают 1—2 уколами в толщу •среды, помещают в термостат и после 18—20-часового выращи­вания выросшие культуры оставляют для хранения. Ватные пробки в пробирках заливают парафином или заменяют на сте­рильные корковые, ампулы запаивают. Штаммы хранят при 4— 6°С, пересевают через 2—3 мес.

Питательный желатин [Хоменко Н. А., Дмитровская Т. С., 1962]

Питательный 10% желатин, разлитый в ампулы, может слу­жить средой для сохранения и пересылки культур.

Приготовление среды описано ранее.

Бактериальные культуры, засеянные уколом в ампулы со средой, после 18—20 ч подращивания помещают в холодильник в запаянных ампулах. Проверку состояния и пересевы сохраняе­мых штаммов производят через 1—2 года.

ИНДИКАТОРЫ

Индикатор Андреде

Состав: Фуксин кислый — 5 г

Натрий гидроокись (NaOH)
1 N раствор — 150 — 180 мл

Вода дистиллированная — 1000 мл

Приготовление: кислый фуксии растворяют в воде и до­бавляют раствор щелочи, перемешивают и оставляют при ком­натной температуре на 24 ч, периодически встряхивая. Цвет должен измениться от красного до коричневого. Если цвет не изменился, то добавляют еще 10 мл щелочи и выдерживают ин­дикатор еще 1 сут.

По другой прописи смешанные ингредиенты выдерживают 24 ч в термостате при 37 °С и затем 48 ч при комнатной темпе­ратуре на свету.

Хранят готовый индикатор в бутыли темного стекла с при­тертой пробкой в обычных условиях.

Бромтимоловый синий (0,2% щелочной раствор)

Состав: Бромтимоловый синий —1г

Натрий гидроокись (NaOH) 0,1 N
раствор —25мл

Вода дистиллированная —475. мл

Бромтимоловый синий (1,6% щелочной раствор)

Соста.в: Бромтимоловый синий — 1,6 г

Натрий гидроокись (NaOH) 0,25 N
раствор — 20 мл

Вода дистиллированная —80 мл

Феноловый красный (0,2% щелочной раствор)

Состав: Феноловый красный —1'г

Натрий гидроокись (NaOH) 0,1 N
раствор —40 мл

Вода дистиллированная —460 мл

Феноловый красный (1,6% щелочной раствор)

Состав: Феноловый красный — 1,6 г

Натрий гидроокись (NaOH) 0,25 N
раствор — 20 мл

Вода дистиллированная —80 мл

Феноловый красный (0,4% водный раствор)

Состав: феноловый красный —0,1 г

Вода дистиллированная стерильная —25 мл

П римечание. Раствор хранят при 4 °С не долее 10 дней.

Феноловый красный (0,2% спиртовой раствор)

— 0,2 г — 100 мл

Состав: Феноловый красный Спирт этиловый 50%

Бромкрезоловый пурпурный (1,6% спиртовой раствор)

Состав: Бромкрезоловый пурпурный —1,6 г

Спирт этиловый 96" — 100 мл

Крезоловый красный (0,1% спиртовой раствор)

Состав: Крезоловый красный —0,1 г

Спирт этиловый 96° — 100 мл

Бриллиантовый зеленый (0,1 или 0,5% водный раствор)

— 0,1или 0,5 г — 100 мл

Состав: Бриллиантовый зеленый Вода дистиллированная Кристаллический фиолетовый (0,01% водный раствор)

Состав: Кристаллический фиолетовый —0,01 г

Вода дистиллированная —100мл ^:

Метиленовый синий (1% водный раствор)

Состав: Метиленовый синий —1 г

Вода дистиллированная — 100 мл

Розоловая кислота (5% спиртовой раствор)

Состав: Розоловая кислота —5 г

Спирт этиловый 96° — 100 мл

Приготовление индикаторных растворов: су­хое красящее вещество растирают в ступке с постепенным до­бавлением горячей воды, щелочи или спирта (в зависимости от характера изготавливаемого раствора). Затем жидкость осто­рожно, смывая ступку, переносят в мерную колбу, добавляя не­обходимое количество води или спирта. Колбу плотно закупо­ривают и помещают на 2—3 дня в термостат (37"С).

После этого индикатор фильтруют через многослойный бу­мажный фильтр и хранят в темных флаконах с притертыми

пробками.

Срок годности не более 1—2 мсс, кроме водного раствора фенолового красного, который можно хранить в холодильнике только до 10 дней.