Состав: Среда Кларка — 1000 мл

Агар порошковидный — 1,9—2,2 г

Приготовление: в среду Кларка добавляют агар и рас­плавляют его при нагревании и помешивании. Затем среду раз­ливают в стерильные пробирки по 4—5 мл и стерилизуют теку­чим паром 3 дня по 20 мин.

Применение: испытуемую культуру засевают уколом и помещают в термостат на 18—24 ч. После инкубации учитыва­ют визуально подвижность (характер помутнения агара) и га­зообразование (наличие пузырьков в толще среды или на ее по­верхности). Затем в пробирку добавляют 4—5 капель 0,04% спиртового раствора метилового красного. При положительной реакции в течение 3—5 мин наступает покраснение. После уче­та реакции а пробирку добавляют 8—10 мл водного раствора КОН и после перехода цвета среды в желтый приливают еще 15—20 капель 5% раствора а-нафтола. Наличие ацетоина учи­тывают через 15—30 мин, при положительной реакции наступа­ет покраснение.

Среды с углеводами [Hiss P., 1904—1905]

Углеводные среды предназначены для дифференциации бак­терий по их способности ферментировать те или иные из угле­водных субстратов.

Принцип действия: углеводы разделяют на моно- и Полисахариды и многоатомные спирты (табл. 113). Соответ-

Таблица ИЗ. Углеводы, используемые в бактериология [Саватеев А. И, 1937; Cowan S., 1974]

Н Химическая	Назван не	Растворимость в воде при 20 °С (масса/%)
• группа
Н Пеитозы	Арабиноза (L+) Ксилоза (древесный сахар) Рамноза (изодульцит)	40 50 40
• Гексоэы	Глюкоза (декстроза) Фруктоза (левулеза)	50 50 ЗП
1,	Галактоза
•	Манноза
•	Сорбоза
Н Диеахяриды	Лактоза (молочный сахар) Мальтоза (солодовый сахар) Сахароза (тростниковый сахар)	15 50 50 10
•	Мелибиоза	*>^
•	Трегалоза (грибной сахар)	2'У
•	Целлобиоэа
1 Трксахариды	Рафнноза Мелинитоза	.10 10
• Полисахариды	Гликоген (животный крахмал)	5 (раствор опалееци-рует)
	Крахмал, растворимый	Растворим в горячей Воде
•		20 при 70 ^3С (рас-
•	Инулин	твор слегка опалссцн-
		рует)
• Гликозиды	Эскулин	0,1; 7,5 при нагрева­нии
•
I	Салицин	7,5
	Дмнгдалин	ш'
	Арбутин
1 Спирты:		Смешивается в лю-
1 трехатомныс	Глицерин	бой пропорции
•
1 четырехатом-	Эритрит
1 пые
пятиатомный	А дон и т
шестиатом-	Дульцит
ные	Маннит	•50
	Сорбит
(не углевод)	Инозит

np.-еча-... К_П™_Й указана, в тай-HW Уколов, „спорую, также ара

тол, декстрин.

от числа входящих в них моносахаридов имеют следующие наи­менования. Дисахариды содержат два моносахарида. К ним от­носят наиболее употребительные: лактоза-н\пюкоза + галактоза, сахароза-»-глюкоза + фруктоза, мальтоза-»-2 единицы глюкозы. Трисахарид рафштоза состоит из трех моносахаридов — глюко­зы, фруктозы и галактозы. Крахмал также является полисаха­ридом.

Многоатомные спирты представляют собой восстановленные

Редукция

моносахариды, например, глюкоза------------»- сорбит (шести­
атомный спирт). Все указанные углеводные субстраты зачастую
называют «сахарами».

Полисахариды являются слишком сложными соединениями для проникновения в бактериальную клетку в качестве пита­тельных веществ. Поэтому они подвергаются расщеплению нэ более простые комплексы — моносахариды — под действием внеклеточных энзимов (пермеаз). Далее действуют внутрикле­точные строго дифференцированные специфические ферменты.

Ферментация — окислительно-восстановительный процесс об­мена веществ, заканчивающийся образованием как восстанов­ленных, так и окисленных продуктов. Пути ферментации и тип конечных продуктов зависят от вида бактерий, природы фермен­тируемого вещества и условий, в которых происходит процесс (температура, рН и т. д.). В общих чертах ферментация это анаэробный процесс, где исходное расщепление углевода (глю­козы) происходит путем первичного фосфорилирования до обра­зования соединения глюкоза-б-фосфат. Конечные продукты фер­ментации углеводов и спиртов в основном сводятся к образова­нию нескольких кислот, спиртов, альдегидов и газообразных ве­ществ (М₂ и С0₂).

Наборы ферментов и пути расщепления углеводов у предста­вителей энтеробактерий различны, что отражается на образова­нии конечных продуктов и служит для дифференциации родов, видов и иногда более мелких внутривидовых категорий. Бакте­рии-ферментаторы являются факультативными анаэробами.

Большинство энтеробактерий имеют тип ферментации раз­личных углеводов, приводящий к образованию смеси кислот (молочной, уксусной, углекислоты и др.). В отличие от этого представители триб Klebsielleae и Erwinieae в качестве конеч­ного продукта ферментации образуют бутилен-гликоль.

— Юг — 5г — 10 мл — 5 или 10 г — 1000 мл

Состав: Пептон

Натрий хлорид (NaCl)

Индикатор Андреде

Углевод

Вода дистиллированная

Примечание. 1. В качестве индикатора рН могут быть использованы растворы бромтимолового синего, фенолового красного или бромкрезолового пурпурного.

2. Среду с лактозой готовят иногда с большим содержанием

сахара (2-10%).

3. К средам может быть добавлен агар (0,2—0,4%).

Приготовление; пептон растворяют в воде при подогре­вании, добавляют натрия хлорид и индикатор, фильтруют, уста­навливают рН 7,1—7,2, стерилизуют при 121 °С 15 мин. К сте­рильной основе добавляют соответствующий углевод в количест­ве: лактозу, глюкозу, маннит или сахарозу 1%; рамнозу, ксилозу» мальтозу, арабинозу, салицин, трсгалозу, рафинозу, целлобиозу, дульцит, сорбит, адонит или глицерин— 0,5%. Разливают в не­большие (агглютмнационные) стерильные пробирки по 3—4 мл„ в пробирки с глюкозой помещают поплавки (перевернутые бро­дильные пробирки Дюрхема). Стерилизуют при ПО °С 30 мин.

В связи с тем что добавление некоторых углеводов может вызвать подкисление среды (легкое порозовение при индикато­ре Андреде), в среду рекомендуется вводить по каплям 0,1 N NaOH до установления исходного цвета (среда должна быть бесцветной, слегка желтоватой).

Дисахариды являются лабильными соединениями, вследствие чего режим их стерилизации должен быть особенно щадящим. Для этой цели применяют стерилизующую фильтрацию через мембранные фильтры с диаметром пор 0,45 мкм или другие сте­рилизующие системы. Фильтрованию подвергают 10% водные растворы углеводов. Более приемлемым для большинства лабо­раторий является метод дробной стерилизации текучим паром¹ (два дня по 30 мин). Предложена для этой цели и стерилизация' при 121 °С 10 мин. Ксилоза, арабиноза, рамноза, салицин и гли­церин также являются лабильными веществами и должны под­вергаться стерилизации в таком же режиме, как и Дисахариды. Все готовые углеводные среды выглядят одинаково и поэто­му, чтобы избежать возможных ошибок, должны быть марки­рованы непосредственно при их изготовлении и далее храниться-' в отдельных, специально обозначенных контейнерах (ящиках,

Ячейках и т. п.).

Примечание. Пептоны, входящие в основу углеводных:

Сред, должны быть свободны от углеводов.

Углеводные среды с индикатором ВР (сухие)

Сухие углеводные среды с глюкозой, лактозой, сахарозой, мальтозой или маннитом служат для дальнейшей дифференциа­ции бактерий но определению их способности ферментировать, тот или иной углевод и выявлению подвижности.

Принцип действия: в отношении ферментации углево­дов тот же, что указан для жидких углеводных сред. Комплекс­ный индикатор ВР (водный голубой + розоловая кислота) улав­ливает изменение рН, меняя цвет от розового (щелочение) че­рез сероватый тон (нейтральная реакция) к голубому и ярко-синему (кислотообразование). В связи с тем что эти среды со-

держат агар, они в готовом виде представляют собой полужид­кий субстрат. Это позволяет учитывать в среде газообразование

(появление пузырьков) и подвижность (диффузное помутнение среды).

Углеводные среды с индикатором ВР выпускают в сухом

виде. Состав сред и способ приготовления указаны на этикетке.

Желатин питательный

Среда предназначена для определения протеолитической (жслатиназной) активности бактерий с целью их дифференциа­ции. Энтеробактерин некоторых родов (протеи, клсбсиеллы, сальмонеллы II—IV подродов) обладают способностью разжи­жать желатин.

Принцип действия: желатин является растворимым белком, полученным обработкой нерастворимого белка живот­ных тканей — коллагена. Химическая структура желатина п кол­лагена одинакова, тогда как физические свойства различны. Желатин расплавляется при температуре около 25 °С.

Бактерии, обладающие ферментом желатиназой, разжижают желатин гидролизом. Подвергаются гидролизу аминокислоты, входящие в желатин, вследствие чего этот белок теряет свои желирующне свойства, оставаясь жидким и при низкой темпе­ратуре.

Питательной основой среды является, бульон Хоттингсра, так
как желатин не содержит питательных веществ, обеспечиваю­
щих успешное развитие бактерий. _^j

Для учета результатов теста на жслатиназу засеянщле про­бирки с желатином охлаждают в вертикальном положений?"—

— 1000 мл — 100 г

Состав: Бульон Хоттингера стерильный

Желатин пищевой высшего сорта

Приготовление: в бульон вносят желатин и оставляют для набухания па 1—2 ч, затем подогревают в водяной бане при 40—50°С до полного расплавления желатина. Устанавли­вают рН 7,2. Если среда мутная, ее просветляют взбитым бел­ком из свежих яиц. Для этой цели белок из 2 куриных яиц хо­рошо размешивают с двойным объемом холодной воды и вносят в среду, которую затем нагревают в кипящей водяной бане или в автоклаве текучим паром 20 мин до свертывания белка. После этого горячую среду фильтруют через ватно-марлевый фильтр и разливают в стерильные пробирки по 8—9 мл. Стерилизуют при 110 °С 30 мин или текучим паром 3 раза по 30 мин.

Среды для определения индолообразования

Среды служат для выращивания энтеробактерий с целью по­следующего определения образования индола.

Принцип действия: среда, содержащая аминокислоту триптофан, служит питательной основой для размножения бак­терий. Обладающие ферментом триптофаназой бактерии рас­щепляют триптофан, образуя индол (орто-бензопиррол), пиро-виноградную кислоту и аммиак. При добавлении к 2-суточной бульонной культуре тест-реактива (кислотно-спиртовой раствор пара-днметиламинобензальдсгида) образовавшийся иидол всту­пает с ним в реакцию, давая розовое или красное окрашивание (реакция на индол положительная).

Состав: Бульон из триптического перевара казеина (1,2— 1,4% аминного азота), содержащий 0,5% хлоридов.

Приготовление: тринтический перевар предварительно проверяют на содержание триптофана и отсутствие индола, устанавливают рН 7,3—7,4, разливают в пробирки по 4—5 мл, стерилизуют при 121 °С 15 мин.

Можно для этой же цели использовать бульон Хоттингера, который всегда содержит триптофан, 2% пептонную воду или 1% пептонпую воду с добавлением 0,3% триптофана.

Тест-реактивы на индол

Реактив Эр лиха

Состав: Пара-диметиламинобеизальдегид — 1 г

Спирт этиловый 96° —95 мя

Кислота хлористоводородная (НС1),
концентрированная —20 мл

Приготовление: растворить альдегид в спирте и доба­вить кислоту. Хранить без, доступа света. Реактив Ковача Состав: Пара-диметиламинобензальдегид —5 г

Спирт амиловый —75 мл

Кислота хлористоводородная (НС1),
концентрированная — 25 мл

Приготовление: растворить альдегид в спирте при лег­ком нагревании (в водяной бане при 50—55 °С). Остудить и до­бавить кислоту. Реактив должен быть желтого цвета. Хранить при 4 ^СС.

Индикаторные бумажки на индол [Gillies R., 1956]

Определять наличие индола можно с помощью индикатор­ных бумажек, помещаемых под пробку над средой — бульоном на триптических переварах или агаром Клиглера, проверенными на содержание триптофана с помощью тест-штаммов или хими­ческим путем.

Свободный триптофан в среде можно обнаружить с помощью качественной реакции, возникающей при взаимодействии вкис-

лой среде триптофана с галоидами (хлором, бромом) и дающей красное окрашивание.

Для этой цели к 5 мл испытуемой среды добавляют 2 капли уксусной кислоты, хорошо перемешивают и по каплям (до появ-.ления розового окрашивания) вносят 1% водный раствор хлор­амина. Последний необходимо хранить без доступа света [Пеш­ков М. А., 1949].

Состав: Пара-диметиламинобензальдегид —5 г
Орто-фосфорная кислота (H₃PCU),
очищенная, концентрированная —10 мл

Спирт метиловый —50 мл

Вместо метилового можно использовать этиловый спирт 96° в том же количестве.

Приготовление: ингредиенты смешивают, как уже было указано. Затем в тепловатом реактиве смачивают лист фильтро­вальной бумаги, которую далее высушивают при комнатной тем­пературе и нарезают полосками (0,5X6 см). Цвет бумажек жел­тый. Хранить в банке темного стекла.

Примечание. Индикаторные бумажки можно пригото­вить, используя реактив Ковача.

i (//"Полужидкий агар для определения подвижности

— 5 г — 120—150 мл — 3—4 г — 1000 мл

Состав: Натрий хлорид (NaCl) Гидролизат Хоттингера Агар Вода дистиллированная

Приготовление: гидролизат Хоттингера разводят водой до содержания в среде 1,3—1,4% аминного азота, добавля-

яот натрий хлорид, устанавливают рН 7,2—7,4, добавляют агар п полностью расплавляют его, подогревая среду при постоянном помешивании. Затем фильтруют в горячем состоянии через мит­калевый фильтр, проверяют прозрачность (визуально) и лри пе-

•обходимости просветляют с помощью яичного белка (см. «Пита­тельный желатин») или освобождаются от мути отстаиванием в

•узких сосудах. Среду разливают по 5 мл в пробирки и стерилизу-

•ют при 121 °С в течение 30 мин.

Готовый полужидкий агар охлаждают в виде столбика. Сре­да должна быть совершенно прозрачной.

\/ Среды с аминокислотами —лизином, орнитином и аргинином

[Moeller V., 1955, 1956], модификация

Эти среды предназначены для определения дифференцирую­щей способности некоторых энтеробактерий расщеплять различ­ные аминокислоты.

Принцип действия: бактерии, обладающие специфиче­скими декарбоксилирующими энзимами, расщепляют аминокис-

лоты в их карбоксильных концевых группах (—СООН), образуя амин или диамин и двуокись углерода (СО₂), изменяя тем са­мым рН среды в щелочную сторону. Бактерии используют лево-вращающие аминокислоты. Процесс декарбоксилирования про­исходит успешно в анаэробных условиях и протекает схематиче­ски следующим образом:

. лияиндекарбоксйлаза

L-лнзии------------ ^г------------ кадаверин (диамин) + СО»;

IvL'j

. орнИтнидекарбоксилаэа

L-орнитнн------------ £?)------------- путресции (диамин) + С0_а.

Кадаверин и путресцин остаются стабильными, если реакция происходит в анаэробных условиях.

L-Аргинин расщепляется бактериями несколько иначе —с по­мощью декарбоксилазной и дегидролазной систем, которые мо­гут осуществляться одновременно или отдельно. Здесь функцио­нирует энзимный комплекс, который через промежуточные про­дукты обмена (L-цитрулин, L-орнитин, мочевина и др,) доводит расщепление аргинина до образования путресцнна + СО₃ и при наличии уреазы до 2МН₃ + СО_г. Реакция, протекающая более быстро и интенсивно, свидетельствует в какой-то мере о гидро-лазном пути усвоения аргинина.

Таким образом, во всех случаях расщепления аминокислот//--' конечные каталитические продукты повышают значение рН. ^

В среды с аминокислотами входит глюкоза, которую все эв> теробакторни ферментируют в 1-е часы, снижая рН, вследствие чего пробирки с аминокислотами и контрольная (без аминокис­лот) желтеют. Через 24 ч инкубации посева и позднее (до 4 сут) при расщеплении аминокислот происходит подщелачи-вание сред, которые становятся фиолетовыми или синеют (при индикаторе бромтнмоловый синий). Цвет контрольной, среды остается желтым.

Состав: Мясная вода — 400 мл

Пептон —5 г

Глюкоза — 1 г

Вода дистиллированная —600 мл

Бромкрезоловый пурпурный (1,6%
спиртовой раствор) —0,6 мл

Крезоловый красный (0,1% спиртовой
раствор) —5 мл

L-Аминокислота — 10 г

Или

DL-Аминокислота —20 г

Примечание. Белковая питательная основа может сосго-
нть, помимо указанной прописи, из 5 г пептона и 3 г дрожжево­
го экстракта или из триптичоского гидролизата казеина (5 мл)
Указанный в прописи оригинальный индикатор рМ может, быть заменен на бромтимоловый синий (1 мл 1,6% спиртового раствора). Используют также пропись, где количество амино­кислот снижено вдвое (до 0,5 и 1% соответственно).

Приготовление: в воде растворяют белковую питатель­ную основу и глюкозу. Устанавливают рН 6,0—6,1. Затем среду делят на 4 равные части. В каждую из трех порций вносят одну из аминокислот (лизни, орнитин или аргинин) в количестве, за­висящем от кристаллизационной формы реактива (L или DL). В последнюю порцию питательной основы аминокислот не до­бавляют,¹ оставляя ее в качестве контрольной. Среды кипятят 5—10 мин и вновь устанавливают рН 6,0—6,1. Во все порциш вносят раствор индикатора, перемешивают, разливают в агглю-тинационные пробирки по 2—3 мл. Стерилизуют при 110^SC. 30 мин.

Среды с органическими кислотами—D-, L- и 1-тартрат, мукат, цитрат [Кауфман Ф., 1959]

Среды предназначены для дифференциации сальмонелл. Принцип действия: в пептонных средах, содержащих оптически активные или инертные образцы винной кислоты (ил» ее солей), а также мукат (слизевую кислоту) или цитрат натрия, определяют способность тех или иных сальмонелл расщеплять с помощью специфических энзимов эти субстраты. Белковой пи­тательной основой сред являемся пептон, индикатором — бром-тимоловый синий. Незасеянные среды имеют синий цвет с чуть зеленоватым оттенком.

¹ При положительной реакции среда постепенно обесцвечива­ется от- зеленовато-желтого цвета до мутно-белого; при отрица­тельной реакции — мутнеет, но остается синей. В среде с мука-том эта реакция отчетлива, тогда как в средах с тартратами и цитратом рекомендуется добавлять тест-реактив. В качестве тест-реактива, повышающего демонстративность п интенсив­ность реакции, применяют насыщенный раствор ацетата свинца. Здесь при положительной реакции выпадает незначительный осадок, а при отрицательной — большой осадок (около ^й/з объе­ма жидкости в пробирке). Реактив следует применять лишь в конце срока инкубации, добавляя в пробирки с отрицательными результатами.

Состав;

Основа: Пептон. — Юг

Натрий гидроокись (NaOH) 0,1 N
раствор —8,5 мл

Бромтимоловый синий (0,2% водный
раствор) —12 мл

Вода дистиллированная — 1000 мл

Органические кислоты:

D-Тартрат (правовращающая соль
винной кислоты) — 10 г

L-Тартрат (левовращающая соль вин­
ной кислоты) —5 г
i (или мезо) -Тартрат (оптически
инертная соль винной кислоты) —5 г
Натрий цитрат, нейтральный — 10 г
Мукат (слизевая кислота) — 10 г

Приготовление: готовят основу среды, стерилизуют при 120 °С 15 мин, добавляют одну из органических кислот, устанав­ливают рН 7,4, асептически разливают в стерильные пробирки по 5—6 мл и стерилизуют текучим паром 20 мин.

Готовить среду можно иначе: «указанной основе присоеди­нить одну из органических кислот, установить рН 7,4, разлить в пробирки и стерилизовать при 112°С 20 мин.

Глицерино-фуксиновый бульон Штерна [Stern W., 19161

Бульон Штерна служит для дифференциации сальмонелл.

Принцип действия: тот же, что указан для агара Эндо. Однако в этой среде вместо лактозы имеется глицерин, из кото­рого некоторые сальмонеллы при ферментации извлекают аль­дегиды. Свежая, незасеянная среда, хранящаяся при 4—б "С, бесцветна. При 37 °С она слегка розовеет. Сальмонеллы, рас­щепляющие глицерин, постепенно подкисляют среду, вызывая ее окрашивание до фиолетового цвета. Наблюдения проводят 8 сут. При отрицательной реакции изменения цвета нет (обязательно в сравнении с контрольной пробцркой).

Состав: Бульон Хоттингера стерильный, рН 8,0 — 1000 мл
Фуксин основной, насыщенный 10%
спиртовой раствор —2,5 мл

Натрий сульфит (Na₂SO₃) 10% вод­
ный раствор —16,6 мл
Глицерин нейтральный — 10 мл

Приготовление: к бульону добавляют спиртовой раствор фуксина, свежеприготовленный 10% водный раствор сульфита натрия и глицерин, хорошо смешивают, разливают в пробирки по 6—7 мл, стерилизуют при 112 "С 15 мин. Хранить среду мож­но в холодильнике не более 14 дней.

Среда Ворфеля —Фергюсона [Worfel M., Farguson W., 1951] в модификации Р, Edwards, W. Ewing (1955)

Среда предназначена для выращивания клебсиелл с целью стимулирования развития у них капсульной субстанции.

Состав: Натрий хлорид (NaCl) —2 г

Калий сульфат (K2SO₄) — 1 г

Магний сульфат (MgSCv7H₂O)

Сахароза

Дрожжевой экстракт сухой

или

Жидкий Агар Вода дистиллированная

Примечание. Возможно применение жидкой среды (без добавления агара) согласно оригинальной прописи.

Приготовление: агар расплавляют в теплой воде, до^ бавляют остальные ингредиенты, растворенные в малых коли­чествах воды, хорошо перемешивают, фильтруют, рН не уста­навливают, разливают в колбы или флаконы, стерилизуют при 121 °С 15 мин. Перед употреблением разливают в чашки Петргг.

Глицериновый агар |Дауман А. Г., 1927}

Глицериновый агар в основном предназначен для внутриви­довой дифференциации шигелл. S. flixneri 1—5 и S. boydii 12 в отличие от других щигелл не сбраживают глицерин.

Принцип действия: дифференцирующее действие основа­но на выявлении способности одних представителей шигелл ферментировать глицерин от других, лишенных этого свойства. При ферментации образуются кислые продукты метаболизма, вследствие чего положительно реагирующие бактерии вызывают яркое порозовение или покраснение среды (через 24—48 ч выра­щивания в термостате). При отрицательной реакции среда оста­ется без изменений или бледнеет за счет щелочения при расщеп­лении белковых субстратов. Белковая основа обеспечивает нор­мальную вегетацию бактерий, что позволяет использовать суточ­ную культуру, выросшую на глицериновом агаре, для серологи­ческой идентификации.

Состав: Агар питательный сухой — 18 г

Вода дистиллированная — 1000 мл

или

Агар (1,8%) на переваре Хоттингсра —1000мл '

Глицерин нейтральный — 10 мл

Индикатор Андредс — 10 мл

Приготовление: расплавляют агар, добавляют глицерин, устанавливают рН 7,2—7,4, добавляют индикатор, хорошо сме­шивают, разливают в пробирки по 6—7 мл, стерилизуют при 112°С 20 мин. Цвет готовой среды бледно-розовый.

Бульон с 0,2% глюкозы для клебсиелд

Бульон с 0,2% глюкозы способствует развитию капсул у клсбсиелл.

Состав: Бульон питательный рН 7,2—7,4 (сте­
рильный) — 1000 мл
Глюкоза —2 г

Приготовление: в небольшом количестве теплого бульо­на растворяют глюкозу, раствор добавляют к остальному бульо­ну, тщательно перемешивают, разливают в стерильные пробирки по 5—6 мл, стерилизуют при 112°С 30 мин.

Среда с KCN [Moeller V., 1954]

Среда предназначена для теста дифференциации энтеробак-терий по их способности расти в присутствии калия цианида.

Принцип действия: одни энтеробактерии (клебсиеллы, гафнии, цитробактеры и некоторые другие) относительно устой­чивы к действию KCN и способны расти в среде при определен­ной его концентрации. Рост других бактерий (например, шигелл, эшерихий) в этой же среде под действием калия цианида пол­ностью подавлен. Среда забуферирована и содержит пептон в качестве питательной основы.

Реакция считается положительной, если через 24—48 ч ин­кубации появится помутнение или легкая опалесценция (замет­ная в сравнении с контрольной незасеянной пробиркой). При отрицательной реакции среда остается прозрачной, в то время как в контрольной пробирке (без KCN) имеется нормальный рост бактерий того же штамма (заметное помутнение).

Состав: Пептон — 10 г

Натрий хлорид (NaCl) —5 г

Калий дигидрофосфат (КН₂Р0₄) —0,225 г

Натрий гидрофосфат (Na₂HPCV —5,64 г •2Н₂0)

Вода дистиллированная — 1000 мл

Калий цианид (KCN) 0,5% водный
раствор — 15 мл

Приготовление: для приготовления основного раствора в дистиллированной воде растворяют пептон и соли, устанавли­вают рН 7,6, фильтруют через бумажный фильтр, разливают во флаконы мерно (по 1000 мл), стерилизуют при 112°С 30 мин или при 121 °С 15 мин, затем быстро охлаждают в холодиль­нике.

Непосредственно перед применением добавляют по 1,5 мл па 100 мл среды свежеприготовленного 0,5% водного раствора ка­лия цианида, хорошо перемешивают и асептически разливают в стерильные агглютинационные пробирки по 1,5—2 мл, быстро закрывают их стерильными корковыми пробками и заливают парафином. В хорошо закупоренных пробирках среда может храниться при 4 °С до 1—2 нед.

Готовая среда должна быть абсолютно прозрачна.

Примечание. Вследствие чрезвычайно высокой токсич­ности KCN получение реактива, хранение и работу с ним про­водят согласно соответствующей инструкции МВД СССР.

V Тест на.р-галактозидазу i[Le Minor L., Ben Hamlda F., 1962]

Тест предназначен для определения р-галактозидазной ак­тивности, характеризующей энтеробактерий, замедленно сбражи­вающие лактозу (некоторые штаммы эшерихий, клебсиелл, цит-робактеров и др.), а также дифференцирующей S. arizonae (тест ONPG положительный) от большинства других сальмо­нелл (тест ONPG отрицательный). Однако этот тест не заменя­ет определение ферментации Лактозы.

Принцип действия: в ферментации лактозы участвуют два энзима: псрмеаза, фермент, способствующий проникнове­нию лактозы внутрь бактериальной клетки и p-D-галактозидаза, внутриклеточный фермент, катализирующий гидролиз лактозы на ее два моносахаридных компонента — галактозу и глюкозу. Поэтому бактерии, утратившие способность продуцировать лак-тоза-пермеазу, являются лактозоотрицательными, но некоторые из них обладают р-галактозидазой. Для того чтобы определить р-галактозидазную активность, применяют О-нитрофепил-p-D-галактопиранозид (ONPG). Этот реагент гидролизуется тем же самым энзимом, p-D-галактозидазой, который гидролизует лак­тозу. Одним из конечных продуктов гидролиза ONPG, бесцвет­ного реактива, является О-нитрофенол— вещество желтого цвета. Поэтому появление желтого цвета в пробирке с бульон­ной культурой испытуемого штамма после добавления тест-ре­актива считается положительной реакцией.

Состав и приготовление реактивов
Реактив 1: буферный раствор рН 7,0
Натрий дигидрофосфат (NaH2PO₄-
•2Н₂О) —6,9 г

Вода дистиллированная —45 мл

С помощью концентрированной гидроокиси натрия (NaOH) устанавливают рП 7,0 и доводят дистиллированной водой объем раствора до 50 мл.

Реактив 2: раствор ONPG
О-нитрофенил-р-галактопиранозид
(ONPG) —80мг

Вода дистиллированная — 15 мл

(растворы 1 и 2 хранят в холодиль­нике).

Реактив 3: натрий хлорид (0,9% сте­
рильный раствор) — ЮО мл
Реактив 4: толуол

Применение: непосредственно перед опытом соединяют в равных количествах реактивы 1 и 2, в объеме, необходимом для

данного опыта. Смесь на несколько минут помещают в термо­стат. Затем к 5 мл 18-часовой бульонной культуры, выращенной при 37 "С, добавляют 0,25 мл 0,9% раствора натрия хлорида, перемешивают и вносят каплю толуола. Пробирку хорошо встряхивают в течение нескольких секунд для извлечения энзи­ма из бактериальных клеток, помещают в термостат. Через 5— 10 мин выдерживания в термостате добавляют в пробирку 0,25 мл свежеприготовленного раствора ONPG и снова помеща­ют в термостат. Учет результатов производят через 20 мин, за­тем через 1, 2, 3 и 24 ч. При 'положительной реакции в пробирке появляется желтое окрашивание, при отрицательной — цвет не изменен.

Основа среды для определения р-галактозидазы энтеробактерий (сухая)

Среда предназначена для выращивания энтеробактерий при определении р-галактозидазиой активности с помощью реакти­ва ONPG, добавленного к питательной основе.

Принцип действия: указан ранее.

Среду выпускают в сухом виде. Состав и подробный способ приготовления указаны на этикетке. Реактив О-нитрофенил-р-D-галактопирапозид прикладывают к среде отдельно.

Среда с глюконатом [Shaw С., Clarke P. П., 1955]

Бульон с глюконатом может быть использован для диффе­ренциации клебсиелл и эшерихнй.

Принцип действия: некоторые бактерии способны пе­реводить окислением глюконат натрия (калия) в 2-кетоглюко-нат, который может быть обнаружен в виде восстановленной субстанции после добавления реактива Бенедикта.

Состав среды: Пептон — 1,5 г

Дрожжевой экстракт — 1 г

Калий гидрофосфат (КгНРО,]) —1 г

Калий глюконат —40 г

Вода дистиллированная — 1000 мл

Примечание. Глюконат калия может быть заменен глюконатом натрия в количестве 37,25 г на 1 л среды.

Приготовление среды: ингредиенты растворяют в во­де при нагревании. Устанавливают рН 7,0, фильтруют, разлива­ют в пробирки по 5 мл и стерилизуют при 115°С 20 мин.

Реактив Бенедикта для теста с глюконатом FCowan Меди сульфат (CuSCvSHjO) Вода дистиллированная

Приготовление: растворить цитрат и карбонат в 60 мл воды. Растворить сульфат меди в 20 мл воды и с постоянным помешиванием добавить в первый раствор. Затем к смеси до­лить воду до полного объема.

Примечание. Раствор легко кристаллизуется при охлаж­дении и должен храниться в теплом месте.

Применение: в среду с глюконатом вносят петлю испы­туемой культуры и выдерживают при 37 °С 48 ч. Затем в про­бирку добавляют 1 мл реактива Бенедикта, смешивают и кипя­тят 10 мин. При положительной реакции образуется коричне­вый, оранжевый или рыжевато-коричневый осадок.

L. S., Тоа-

Среда для определения лецитиназы [McClung be Т., 1974]

Тест определения лецитииазы можно применять для внутри-родовой дифференциации иерсиний, хотя предложен он был для идентификации патогенных анаэробов.

Принцип действия: бактерии, обладающие энзимом ле-цнтипазой, относящейся к фосфолиназам, способны расщеп­лять гидролизом лецитин, органическое вещество из группы фос-фатидов. В состав среды входит яичный желток, содержащий большое количество лецитина. Вокруг выросших на среде коло­ний, состоящих из бактерий, обладающих лецитиназой, возника­ет опалесцирующая зона. Она образуется, как предполагают, за счет жиров (формирующихся под действием лецитиназы и сво­бодных жиров желтка) и водонерастворимых белков яичного желтка, которые образуют преципитат со свободными жирами.

-40 г -5 г •1 г -2г •ОД г •2г -25 г -1000 мл -2 шт.

Состав: Казеин панкреатического переварива­ния

Натрий гидрофосфат (Na₂HPO₄) Калий дигидрофосфат (КН₂РО₄) Натрий хлорид (NaCl) Магний сульфат (MgSCv7H₂0) Глюкоза Агар

Вода дистиллированная Яйцо куриное

Приготовление: агар, питательную основу, соли и дру­гие ингредиенты смешивают и расплавляют, устанавливают рН 7,6, разливают в колбы, автоклавиругот при 121 °С 15 мин, охлаждают до 50—55'°С. Тем временем тщательно щеткой от­мывают в проточной воде яйца и помещают их на 1 ч в 96° спирт. Затем асептически отсасывают желтки, добавляют по одному

желтку в колбу с 500 мл охлажденной среды, суспендируют их стерильной пипеткой. Готовую среду немедленно разливают в чашки Петри с соблюдением стерильности.

Среда для определения триптофандезаминазы [Singer J Volcani В. Е., 1955]

Среда предназначена для дифференциации энтеробактерий по их способности дезаминировать аминокислоту триптофан. Положительная реакция характерна для протеев. Среда с трип­тофаном может заменять среду с фенилаланином.

Принцип действия: бактерии, обладающие триптофан-дезаминазой, расщепляют триптофан с образованием соедине­ния индол-3-пировиноградная кислота, что может быть выявле­но при добавлении.раствора хлорида желоза(Ш): появление вишнево-красного окрашивания.

Состав: DL-Триптофан —2 г

Вода дистиллированная — 1000 мл

Готовая среда имеет рН 6,7—6,9.

Постановка реакции: подозрительную колонию поме­щают в пробирку с 0,2—0,5 мл раствора триптофана и выдерг живают в термостате при 37 °С 30 мин. Затем добавляют 1 кап­лю 10% водного раствора хлорида железа (111) (см. «Агар с фенилаланином»), встряхивают и через 5 мин учитывают реак­цию (вишнево-красный цвет при положительной реакции, жел­тый— при отрицательной).

СРЕДЫ И РЕАГЕНТЫ