Ускоренные и упрощенные методы бактериологического исследования

За последнее десятилетие в мировой практике предложено значительное число ускоренных и упрощенных методов идентификации энтеробактерий. Эти методы основаны на выборе наиболее важных дифференцирующих признаков, для определения принадлежности бактерий к семейству и роду, а иногда виду. Выбор наиболее существенных тестов, продуманное увеличение их числа, оптимальная для данных условий рецептура сред и удобство оформления наборов создают надежность и эффективность тех или иных идентифицирующих систем.

Такие системы, в основе которых лежит единый принцип — рациональный набор дифференцирующих субстратов, сконструированы различно. Это могут быть комбинированные среды в пробирках, наборы микроконтейнеров, содержащих отдельные субстраты, диски, полоски бумаги или бумажные поплавки, пропитанные определенными ингредиентами, индикаторные карандаши. Одни из них предназначены для полной идентификации, другие — для ускорения и упрощения отдельных этапов анализа.

К числу комбинированных или комплексных сред, в которых возможно определение нескольких основных признаков, относят такие широко известные среды, как среды Клиглера, Олькеницкого, трехсахарный агар с солями железа (TSI), среду Ресселя, агар с лизином и солями железа (LIA) и им подобные, выпускаемые в сухом виде или изготовляемые непосредственно в лабораториях.

В последние годы были описаны многочисленные комбинированные среды и в нашей стране. Так, Г. П. Калина предложил ряд комбинированных сред, в частности в 1978 г. двухслойную универсальную комплексную среду — ДУКС, предназначенную дли сигнальной идентификации энтеробактерий и сходных с ними грамотрицательных микробов. С помощью ДУКС можно определить в одной пробирке образование сероводорода, ферментацию глюкозы, лактозы или сахарозы, наличие уреазы. Преимущество ДУКС перед средой Олькеницкого заключается в таком расположении мочевины в пробирке, при котором ее расщепление не мешает учету ферментации углеводов. Г. Д. Серов в 1977 г. рекомендовал полужидкую среду, приготавливаемую на основе среды Кларка, где в одной пробирке можно определить реакции с метиловым красным и Фогеса—Проскауэра, подвижность, образование газа в глюкозе. Введение в первичный дифференцирующий ряд этой среды даст несомненные преимущество во времени, так как учет реакции производят через 18—24 ч.

Как уже было указано, помимо комбинированных сред для разных этапов бактериологического анализа, разработаны комерческие мультисистемы для полной идентификации энтеробактерий

За рубежом некоторые из них получили широкое распространение: «Enterotube», API20E, Pathotec, R/B, Micro-ID и другие. Анализ результатов их применения выявил достоинства и недостатки. Оказалось, что «возраст» и концентрация инокулята могут существенно изменять результаты исследования. Вместе с тем не исключены выделение смешанных культур, особенно в системе «Enterotube», или опасность заражения персонала при работе с API-системой, а также другие моменты [Mac Faddin J., 1981].

В качестве примера коммерческих пробирочных систем назовем известную R/B-систему, наименование которой происходит от фамилий авторов (Rollender — Beckford). Первоначально она состояла из двух пробирок: в первой из них определяли ферментацию лактозы и глюкозы, образование сероводорода, фенилаланиндезаминазу и лизиндекарбоксилазу, а во второй — подвижность, образование индола и орнитиндекарбоксилазу. Позднее система была дополнена еще двумя пробирками (первая с цитратом и рамнозой, вторая с рафинозой, сорбитом, арабинозой и субстратом для определения ДНК-азы). Названные дополнительные тесты позволили с высокой точностью дифференцировать все родовые группы энтеробактерий [Hayek L., Willis G., 1977].

Заслуживает большого внимания известная система «Enterotube», представляющая собой пластиковую трубку, разделенную на 8 камер, содержащих готовые для посева питательные среды с индикаторами. В ней можно определить 9 существенных для идентификации признаков (сбраживание глюкозы, лактозы и дульцита, образование сероводорода и индола, утилизация цитрата, мочевины, фенилаланина, декарбоксилирование лизина). Удобство работы с системой «Enterotube» обеспечивает специальная вмонтированная в трубку проволочная петля, которой снимают изолированную колонию с чашки первичного посева. Через отверстия в перегородках камер петлю протягивают через все камеры, заражая каждую из них. Совпадение результатов идентификации при сопоставлении с классическим методом для большинства энтеробактерий достигало 96,4%. О некоторых недостатках системы уже упоминалось. Ложные реакции, отрицательные при недостаточной посевной дозе и положительные при избыточной наблюдались в основном на средах с фенилаланином, цитратом, мочевиной, а также при образовании газа из глюкозы [Mac Faddin J., 1981]. Нашло признание сочетание использования системы «Enterotube» с компьютерной обработкой результатов [Izard D. et al., 1977]. Это так называемые ENCISE I — схема 1-й генерации, идентифицирующая до рода, и ENCISE II — схема 2-й генерации, идентифицирующая до вида. Применение этих схем позволило установить недостатки системы и предложить пути их устранения.

Широкое признание за рубежом получила система API 20E, сконструированная в виде пластиковой полосы с 20 микроконтейнерами, содержащими набор сухих питательных сред с различными субстратами или реактивами. В их числе дифференцирующие аминокислоты, углеводы, желатин, мочевина, реактивы на сероводород, индол, ацетоин, β-галактозидазу и др. В каждый микроконтейнер пастеровской пипеткой вносят необходимое количество микробной взвеси. Пластину помещают в специальный футляр и выдерживают при 370С в течение 18—24 ч.

API 20Е-система позволяет с достаточной точностью идентифицировать до 96,4% энтеробактерий. Недостатками системы считают возможность высыхания сред в лунках в течение инкубации, появление ложноположительных реакций в среде с лизином при выращивании протеев и др.

Положительную оценку получил и сравнительно новый набор Micro-ID-система, включающая 15 основных дифференцирующих биохимических тестов. Это набор бумажных индикаторных дисков, размещенных в лунках пластикового лотка. Существенным является то, что максимальный срок учета результатов составляет 4 ч. По сравнению с общепринятым методом Micro-ID-система дает 1,5% ошибок, тогда как API 20E—4,7% по данным S. Edberg. с соавт. (1979). Сравнительную идентификацию авторы осуществляли с помощью компьютера.

Практическое применение нашли и системы тестов для ускоренной диагностики, оформленные в виде наборов бумажек, пропитанных дифференцирующими реагентами. Из них наиболее известен коммерческий набор PathoTec [Mac Faddin J., 1981], представляющий собой бумажные полоски, снабженные индикаторными поясками и предназначенные для выявления ферментов или конечных продуктов обмена веществ. Система позволяет определять до 10 признаков. Учет реакции в большинстве тестов через 1—4 ч. По данным Н. А. Хоменко (1977), тесты на цитохромоксидазу, нитратредуктазу, фенилаланиндезаминазу, образование индола и ацетоина обеспечивали надежные результаты для всех испытанных родов энтеробактерий. Для шигелл с контрольными совпадали также результаты, полученные в средах с лизином, цитратом и мочевиной.

Сравнительное изучение наиболее популярных мультисистем («Enterotube, API 10E, API 20E, PathoTec и др.) в сопоставлении с классическим методом бактериологической идентификации привело большинство исследователей к выводам, совпадающим с данным A. Courtieu и F. Goudard (1978) о том, что система PathoTec обеспечивает совпадение результатов с традиционным методом в 91,8%, «Enterotube» — в 84,7%, API 10E — в 96,9%, a API 20E — в 99,6% случаев.

В нашей стране В. М. Никитиным и С. В. Плугару в 1972— гг. были разработаны углеводные бумажные диски (УБД), пропитанные углеводами с индикаторами и покрытые защитной пленкой. Реагенты совмещали с культурами, выращенными в агаровой или в жидких средах [Никитин В. М., Плугару С, В., 1979].

Тем же коллективом (кафедра микробиологии Кишиневского медицинского института) созданы также индикаторные углеводно-бумажные поплавки (УБП), позволяющие определять ферментативную активность бактерий в жидких средах (в пептоннной воде, слабощелочных бульонах, стерильной водопроводной воде или изотоническом растворе натрия хлорида), помещая их в пробирки или лунки пластиковых панелей [Никитин В. М., Плугару С. В., 1979]. Набор углеводных сред пополнен также средами с солями органических кислот (ацетат, тартрат, малонат, цитрат), что значительно расширяет возможности дифференциации [Никитин В. М. и др., 1978].

Особый интерес представляют разработанные упомянутыми авторами и другие тест-системы. Так, на бумажной карте размещены в шахматном порядке 20 углеводных субстратов (различных или одноименных в зависимости от цели исследования). На эти.субстраты петлей наносят испытуемую культуру и после кратковременной инкубации при 37 °С (от 15 мин до 2—5 ч) учитывают результат. Предложен также оригинальный набор «фермент-карандашей», содержащих ферментируемый субстрат и индикатор рН в жировосковой основе, которые позволяют немедленно определять отношение микроорганизмов к субстратам, нанесенным в виде карандашного штриха на обычное стекло [Никитин В. М., Плугару С, В., 1979]. Кроме того, предложены новые разновидности устройств для ускоренного определения биохимической активности бактерий: полисубстратная тест-система (ПТС) в виде диска с тест-субстратами, помещаемого в чашку Петри, и энзимо-индикаторная лента (ЭЛ) [Георгица Ф. И„ 1981].

Большая работа по созданию и апробации новых бумажных тестов (на уреазу, лизин- и орнитиндекарбоксилазу, аргининдегидролазу, цитохромоксидазу, индолообразование) проведена в Горьковском НИИ эпидемиологии и микробиологии И. II. Блохиной, В. М. Лавровской, Р. Ш. Альтман и др. (1977, 1978).

В нашей стране осуществляется производственный выпуск систем, именуемых СИБ (системы индикаторные бумажные) для ускоренной идентификации энтеробактерий и вибрионов. Они представляют собой пропитанные тем или иным субстратом.(углеводом, аминокислотой и др.) и индикатором диски (диаметром 0,9—1,0 см) или полоски (длиной 8—10 см и шириной до 1 см) хроматографической бумаги, стабилизированные полимерным покрытием (водным раствором поливинилового спирта). Желатиназу определяют с помощью диска из засвеченной и проявленной фотопленки.

Названные системы выпускает Горьковский НИИ эпидемиологии и микробиологии в виде нескольких наборов (№ 1, №2«А», № 2«Б» и № 3) разного целевого назначения [Андреева 3. М и др., 1983].

Набор № 1, включающий 13 наименований, предназначен для идентификации вибрионов.

Набор № 2«А» — малый, включающий 9 наименований, предназначен для межродовой дифференциации энтеробактерий. Он позволяет определять следующие тесты: ферментацию лактозы, β-галактозидазу, утилизацию цитрата и малоната, гидролиз мочевины, дезаминирование фенилаланина, декарбоксилирование лизина, образоване индола и сероводорода.

Набор № 2«Б»— расширенный, включающий 25 наименований, предусматривает возможность видовой идентификации энтеробактерий по отношению к глюкозе, лактозе, сахарозе, арабинозе, манниту, инозиту, рамнозе, ксилозе, мальтозе, сорбиту, адониту, салицину, дульциту, лизину, орнитину, фенилаланину, утилизации малоната и цитрата, образованию индола и сероводорода, выявлению оксидазы, β-галактозидазы, уреазы, желатиназы.

Набор № 3, предназначенный для ускоренного определения обсемененности воды кишечной палочкой, состоит из 2 компонентов, обеспечивающих определение ферментации глюкозы и теста на оксидазу.

Срок годности наборов для идентификации энтерабактерий (№ 2«А» и № 2«Б») один год.

Для воспроизведения аминокислотных тестов и определения утилизации цитрата и малоната к наборам прилагают забуференый изотонический раствор натрия хлорида рН 5,4—5,6.

Работа с СИБ требует наличия чистой 18—24-часовой агаровой культуры испытуемого микроба. Для воспроизведения тестов на ферментацию углеводов можно использовать как материал, взятый бактериологической петлей, так и капли микробной взвеси в растворе натрия хлорида или бульоне.

Для определения цитохромоксидазы суточную агаровую культуру растирают петлей на соответствующей индикаторной бумажке, помещенной в чашку Петри. Оксидазоположительные культуры (не энтеробактерий) дают при этом синее окрашивание, появляющееся в течение 30—60 сек; а оксидазоотрицательные не изменяют окраски индикаторной бумажки. На одной бумажке можно испытать не более 10—15 культур.

Образование индола определяют в пробирках с 0,2—0,3 мл изотонического раствора натрия хлорида рН 7,2—7,4, в котором суспендируют полную бактериологическую петлю суточной агаровой культуры, а затем стерильным пинцетом опускают в пробирку сложенную вдвое «индольную» бумажку так, чтобы короткий конец (имеющий желтовато-серую окраску) находился над поверхностью суспензии. Инкубацию посевов проводят при 37°С в течение 2 ч, однако, как правило, положительный результат — красно-малиновое окрашивание короткого конца бумажки — выявляют уже через 30—40 мин.

Для определения гидролиза мочевины в пробирки с приготовленной описанным путем суспензией культуры помещают индикаторный диск, инкубируют при 37 °С 2 ч. Положительная реакция в виде розово-малинового окрашивания обычно проявляется через 30—40 мин.

Способность дезаминировать фенилаланин определяют в суспензии культуры, погружая в нее диск с фенилаланином. После одного часа инкубации при 37 °С в эту же пробирку погружают другой диск — с хлорным железом. При положительном результате через 10—15 сек появляется зеленое окрашиваиие.

Наличие у культуры β-галактозидазы выявляют, помещая в суспензию культуры соответствующий диск с последующей инкубацией при 37 °С в течение 4—5 ч. Предварительный учет возможен через 1 ч. При положительной реакции диск становится желтым.

Образование сероводорода определяют при выращивании культур в чашках Петри на слабощелочном агаре или в пробирках с полужидким питательным агаром (0,4—0,6%), рН 7,2—7,4. Посев испытуемых агаровых суточных культур на поверхность агара в чашке Петри делают петлей в виде площадок (около 0,5 см²), поверх которых помещают индикаторные диски, затем чашку ставят в термостат на 18—24 ч при 37 ⁰С. Предварительный учет возможен через 5 ч. Положительная реакция проявляется в виде почернения диска или среды под ним. При пробирочном методе диск помещают на поверхность полужидкого агара, предварительно засеянного уколом (суточной агаровой культурой). Инкубация и учет аналогичны указанным выше. В пробирке с полужидким агаром можно одновременно определять подвижность бактерий.

Определение желатиназной активности проводят в суспензии суточной агаровой культуры испытуемого штамма (в 0,2—0,3 мл изотонического раствора натрия хлорида, рН 7,2—7,4), помещая в нее диск засвеченной и проявленной фотопленки, с последующей инкубацией при 37⁰С 18—24 ч. Предварительный учет возможен через 4—5 ч. Положительный результат выражается в просветлении диска фотопленки и выпадении черного осадка восстановленного серебра.

При определении отношения к аминокислотам, а также утилизации цитратa и малоната полную бактериологическую петлю суточной агаровой культуры испытуемого штамма необходимо суспендировать в 0,2—0,3 мл забуференного раствора натрия хлорида рН 5,4—5,6, после чего в пробирки стерильным пинцетом помещают соответствующие тесту индикаторные диски и выдерживают при 37 °С 18—24 ч. Содержимое пробирок, в которые помещены «аминокислотные» диски, заливают стерильным вазелиновым маслом (0,1—0,2 мл). В тестах на утилизацию цитрата и малоната возможен предварительный учет через 5 ч. Положительный результат в этих тестах проявляется малиново-красным окрашиванием, в тестах с аминокислотами—синим или интенсивно зеленым.

Ферментацию углеводов можно определять на плотной агаровой среде в чашках Петри (10—12 мл питательного агара, рН 7,2—7,4) или в пробирках, содержащих по 0,2—0,3 мл изотонического раствора натрия хлорида или 1% пептонной воды, рН 7,2—7,4. При применении чашечного метода посевы культуры делают петлей в виде площадок или наносят на поверхность агара капли смыва культуры, на которые накладывают флам-бированным пинцетом «углеводные» диски. На одной чашке испытывают не более 6—7 культур. Для определения газообразования из глюкозы на диски с глюкозой наносят 4—5 капель расплавленного и охлажденного до 45 °С полужидкого (0,6— 0,8%) агара. При пробирочном методе культуру вносят петлей в 0,2—0,3 мл указанной жидкости, после чего в каждую пробирку погружают стерильным пинцетом диск с углеводом.

Чашки или пробирки инкубируют в термостате при 37 °С 5 ч. Диски, помещенные на чашки с агаром, при ферментации углевода изменяют свой цвет из красного в желтый (иногда изменяется и окраска среды вокруг диска). При испытании в пробирках через тот же срок при положительном результате среда приобретает желтую окраску различных оттенков.

В более поздние сроки учет ферментации углеводов на агаровых чашках может быть затруднен в результате подщелачивания среды за счет протеолиза белков (возможно восстановление красного окрашивания дисков). Тесты, воспроизведенные в пробирках, можно учитывать и через 18—24 ч, но для оценки газообразования при этом необходимо помещать в среду при посеве маленькие кусочки стерильной гигроскопической ваты.

К числу недостатков, которые могут иметь место при СИБ, следует отнести нечеткость получаемых результатов, что может быть связано с недостаточной концентрацией микробных клеток в опытной пробирке, несоблюдением режима рН (погрешности в обработке посуды при использовании моющих средств), работой со смешанной культурой или некоторыми другими обстоя­тельствами.

Несмотря на всю перспективность указанных способов ускоренной и упрощенной идентификации бактерий, их преимущества при массовых исследованиях (экономии времени, питательных сред, посуды, труда и других затрат), эти методы не должны в обычных условиях противопоставляться общепринятому классическому методу идентификации бактерий.

О некоторых недостатках и ограниченных возможностях упомянутых систем уже было сказано. Кроме того, известно, что каждый анализ должен быть завершен выделением чистой культуры для ее дальнейшей идентификации (определение антигенной формулы, фаговара и т. д.), что возможно не при всех мультисистемах. Помимо этого, для идентификации представителей такого сложного семейства, как Enterobacteriaceae. обладающих разнообразной ферментативной активностью и значительными отклонениями от обычных признаков, требуется особенно высокая квалификация бактериологов, способных внести должные коррективы при применении ускоренных методов и дополнить их рядом обычных тестов. В противном случае диагностические ошибки будут неизбежны. Аналогичные соображения высказаны и авторами ведущих зарубежных руководств [Ewing W., Martin W., 1974; Cowan S-, 1974; Mac Faddin, 1981].