Генная диагностика и генная терапия

Генная диагностика имеет большое будущее в экспресс-диагностике инфекционных болезней. На ранних этапах инфекции, когда АТ в организме ещё не выработаны, диагностика основана на идентификации Аг, в том числе специфических генов возбудителя. Для этого выявления наиболее часто применяют методы гибридизации и амплификации ДНК (см. также главу 11).

Генная терапия — метод лечения заболеваний, основанный на переносе в клетки организма определённых генов. Основная проблема генной терапии — разработка эффективного и безопасного способа переноса необходимых генов в дефектные клетки организма. В качестве «средств доставки» генов используют различные векторы, наиболее часто — различные вирусы (см. ниже). В настоящее время разработки генной терапии касаются только соматических клеток. 14 сентября 1990 г. была проведена первая успешная попытка коррекции генных дефектов при наследуемом T-клеточном иммунодефиците, связанном с недостаточностью фермента аденозин дезаминазы. Двум больным девочкам провели пересадку собственных T-лимфоцитов, в которые был внесён трансген — нормальный ген недостающего фермента. В результате нескольких проведённых инфузий у обеих пациенток наступило полное выздоровление. В настоящее время несколько тысяч больных несут в своём организме клетки, генетически изменённые искусственным путём. В 1992 г. в США осуществили введение в клетки печени человека гена белка-рецептора, адсорбирующего липопротеины низкой плотности в гепатоциты женщины, страдающей выраженным атеросклерозом (патология была связана с дефицитом липопротеинов вследствие генных нарушений). Посредством трансфекции ген был введён в гомогенизированные клетки печени, которые затем переносили в печень пациентки. После такой процедуры состояние женщины улучшилось, хотя до пересадки «генно-инженерной печени» она перенесла инфаркт (в 16 лет) и операцию на сердце (в 26 лет).

Виды генной терапии

В настоящее время разработаны три основных вида генной терапии, различаемых по способу доставки вектора в поражённые клетки.

Генная терапия exvivo. Поражённые клетки выделяют из организма пациента, инкубируют с вектором, после чего генно-инженерные (генетически изменённые) клетки вносят в организм. Наиболее часто метод применяют в отношении клеток крови. Это связано с простотой их выделения и последующего обратного введения.

Генная терапия insitu. В этом случае вектор вводят непосредственно в поражённые ткани. Например, пациентам с муковисцидозом аденовирусные векторы доставляют непосредственно в трахею и бронхи; в некоторые опухоли непосредственно инъецируют вектор, несущий цитокин или токсин; в мышцу больного, страдающего мышечной дистрофией, производят инъекцию вектора, несущего ген дистрофина.

Генная терапия invivo — вектор вводят в кровоток. До настоящего времени на практике этот метод не применяли, однако метод прост и удобен, поэтому его считают наиболее перспективным.

Векторы

Как было указано выше, для переноса соответствующих генов в клетку используют различные векторы [от лат. vector, переносчик]. Основная проблема при их разработке — преодоление иммунологического барьера реципиента, ограждающего организм от различных внешних воздействий, в том числе и от внедрения чужеродной ДНК в геном клеток. В этом плане особый интерес представляют вирусы, так как из всех известных агентов лишь они способны более или менее успешно интегрировать генетический материал в геном клеток человека. Поэтому все усилия специалистов генной терапии на настоящий момент сконцентрированы в области генной инженерии вирусов, применяемых в качестве векторов, доставляющих терапевтические гены в клетки организма больного.

Векторы на основе РНК - овых вирусов. РНК-геномные вирусы легко интегрируют в геном клетки-хозяина, тем самым обеспечивая долговременную экспрессию необходимого гена. Для создания генно-терапевтических векторов наиболее перспективны ретровирусы. С их участием проведено около 60% всех клинических попыток генной терапии.

Ретровирусы относительно безвредны для человека, исключая, конечно, ВИЧ и T-лимфотропные вирусы человека. Наиболее часто в качестве вектора применяют вирус лейкемии мышей. При разработке векторов из их состава полностью исключают гены, кодирующие синтез продуктов, обеспечивающих репродукцию. Кодирующая ёмкость трансгенов в составе ретровирусных векторов не превышает 8000 пар оснований нуклеиновых кислот.

Основные проблемы применения РНК-вирусных векторов — эффективная доставка генетического материала в клетки, поддержка долговременной экспрессии и трансдукция неделящихся клеток (большинство РНК-векторов неспособно к эффективному переносу трансгенов в покоящиеся клетки). Однако неспособность ретровирусов к трансдукции покоящихся клеток в конкретной ситуации может оказаться и выгодной, например, в генной терапии глиобластом (злокачественные опухоли мозга). Идея их применения заключается в избирательной трансдукции делящихся клеток в очаге поражения — опухолевых клеток и клеток сосудов; нервные клетки не делятся и потому не служат мишенью ретровирусных векторов.

Векторы на основе ДНК - геномных вирусов. Векторы, созданные на основе ДНК-вирусов обладают бЏльшими размерами по сравнению с РНК-геномными вирусами и поэтому, могут вмещать фрагменты ДНК (трансгены) длиной до 35 000 пар оснований.

• Аденовирусные векторы. На основе аденовирусов создают векторы для генной терапии in situ муковисцидоза и злокачественных опухолей. Аденовирусные векторы способны к высокоэффективной трансдукции большого спектра клеточных типов человека, включая неделящиеся клетки. Особое внимание заслуживают векторы на основе аденоассоциированного вируса. Аденоассоциированный вирус — непатогенный вирус, широко распространённый у человека (АТ к его Аг обнаруживают у 80% людей). Вирус тропен к определённой части генома — он интегрируется преимущественно с коротким плечом хромосомы 19. В экспериментах показана эффективность векторов, созданных на основе аденоассоциированного вируса, в трансдукции клеток мозга, скелетных мышц и печени.

• Другие ДНК-геномные вирусы. Среди остальных ДНК-содержащих вирусов относительно часто применяют вирус простого герпеса (ВПГ), проявляющий тропность к нервной ткани (соответственно используют для трансдукции клеток мозга).

Невирусные векторы (молекулы ДНК со свойствами транспозонов или вставочных последовательностей) менее распространены, чем векторы на основе вирусов. Тем не менее, невирусные векторы обладают многими преимуществами, такими как безопасность и простота конструирования. Путём констрирования синтетической системы по доставке генов внутрь клетки можно избежать опасности продуцирования рекомбинантного вируса или других токсических эффектов.

Перспективы генной терапии

Несмотря на низкой риск развития побочных реакций, связанных с генной терапией, эффективность переноса генов и их последующей экспрессии в клетках остаётся невысокой. Последнее связано со сложностями чёткой идентификации генов, кодирующих синтез тех или иных белков; трудностями их выделения и подбора соответствующих векторов. Поэтому проводимые в настоящее время клинические эксперименты можно определить как начальные стадии испытаний генной терапии, вовлекающие очень ограниченное число пациентов. Исходя из этого, методы коррекции генетических «сбоев» необходимо разрабатывать применительно к тяжёлым заболеваниям (злокачественные опухоли, наследуемые болезни, синдром приобретённого иммунодефицита (СПИД), аутоиммунные расстройства, ишемическая болезнь сердца). Тем не менее, накопление информации о генной терапии и ложные представления о невысоком риске развития побочных реакций создают опасные предпосылки для внедрения методов генной терапии в лечение патологических состояний, непосредственно не угрожающих жизни больного, коррекции косметических дефектов и улучшения общего состояния организма. Например, методы генной терапии применимы к лечению облысения, а трансдукция гена гормона роста может привести к росту организма, гена дистрофина — к наращиванию мышечной массы. К таким фривольным попыткам применения генной терапии следует подходить крайне осторожно — большинство учёных и врачей сходятся во мнении, что посягательства на геном человека на настоящий момент допустимы лишь в крайних случаях, каковыми являются угрожающие жизни состояния. Медицинское сообщество не может быть абсолютно уверено в отсутствии у генной терапии отдалённых негативных эффектов. По этим же причинам, не следует применять генную терапию в отношении половых клеток.

Глава 8

· Учение об инфекции

В этой главе рассмотрены вопросы, характеризующие патогенность и вирулентность микроорганизмов, факторы их патогенности и вирулентности, особенности течения инфекционного процесса и эпидемиологии инфекционных болезней.