Характерные проявления взаимодействий между вирусом и чувствительными клетками — видимые поражения заражённых клеток вплоть до их гибели, а также присутствие возбудителя в исследуемом материале.

Альтерация и воспаление. При вирусных инфекциях на первый план выступает картина повреждения клеток и воспалительных изменений тканей, при различных инфекциях их соотношение и выраженность варьируют. В противоположность бактериальным инфекциям (где доминируют полиморфноядерные лейкоциты), при вирусных поражениях среди клеточных элементов воспалительных реакций доминируют мононуклеары (лимфо- и моноциты). На этапах, предшествующих разрушению клеток, можно визуально наблюдать их дегенеративные и некротические изменения.

Форма клеток. Вследствие поражения цитоскелета клетки принимают округлую форму.

Изменения структуры ядра достаточно разнообразны: кариопикноз [сморщивание ядра клетки при дистрофических изменениях в ней (от греч. karion, ядро, + pyknosis, уплотнение)], краевое расположение глыбок хроматина, его распыление и т.д. Подобные поражения способны вызывать адено-, герпес-, парамиксо-, ортомиксо- и ретровирусы.

Плазмолемма (ЦПМ). Изменения её структуры связанно с замещением собственных гликопротеинов вирусиндуцированными белками. Эти поражения характерны для инфекций, вызванных оболочечными вирусами, но некоторые «голые» вирусы также могут вызвать изменения клеточной мембраны. Нарушение структуры плазмолеммы может приводить к изменению некоторых её характеристик (например, к увеличению её проницаемости или слиянию с незаражёнными клетками). В последнем случае можно наблюдать образование симпластов (поликариоцитов) и синцитиев. Симпласты представлены гигантскими многоядерными клетками (например, клетки ЦЊнка, выявляемые при герпетических поражениях), образующимися в результате модификации ЦПМ лизосомальными ферментами. Реже наблюдают образование синцитиев — больших конгломератов цитоплазмы, содержащий сотни и тысячи ядер связанных между собой клеток. Образование синцитиев обусловлено модификацией ЦПМ поверхностными гликопротеинами и характерно для парамиксовирусов.

Тельца включений. Микроскопия заражённых клеток часто позволяет выявить тельца включений — характерный, но не абсолютный признак вирусных поражений. Тельца значительно крупнее, чем отдельные вирионы, и часто окрашиваются кислыми красителями (например, эозином).

• В одних случаях (например, при натуральной оспе) включения играют роль «вирусных фабрик», где собираются дочерние популяции, в других — служат депо побочных продуктов (например, при герпесвирусных инфекциях).

• При заражении клеток ДНК-содержащими вирусами тельца включений располагаются в ядре; исключение — тельца включений поксвирусов (тельца ГварнЌри).

• При заражении клеток РНК-содержащими вирусами тельца включений располагаются в цитоплазме (например, тельца БЊбеша–НЌгри, выявляемые в цитоплазме клеток головного мозга при бешенстве).

Причины гибели клеток. Размножаясь в клетке, вирусы индуцируют синтез вирусоспецифических белков, в той или иной степени подавляющих метаболизм клетки.

Нарушение синтеза макромолекул вызвано нарушением трансляции клеточной мРНК. Среди РНК-геномных вирусов наиболее быстрое и глубокое подавление макромолекулярных синтезов в клетке вызывают пикорнавирусы, среди ДНК-геномных — покс- и герпесвирусы. Действие указанных вирусов реализуется на ранних этапах (до появления морфологических признаков цитопатического эффекта).

Ингибирование синтеза РНК и ДНК обычно вторично по отношению к воздействию на белки, контролирующие экспрессию генов и пролиферацию клетки. Значительно реже нарушения вызывают вирусные белки, напрямую ингибирующие синтез нуклеиновых кислот. Среди РНК-геномных вирусов наиболее быстрое и глубокое подавление синтезов нуклеиновых кислот вызывают пикорнавирусы, среди ДНК-геномных — покс- и герпесвирусы.

Во время репродукции вируса в клетке накапливаются вирусные компоненты, оказывающие токсическое и повреждающее действие на клеточные структуры. Например, цитотоксические свойства проявляют капсомеры некоторых аденовирусов, гликопротеины парамиксовирусов. В процессе вирусной инфекции также происходит повреждение мембран лизосом, содержимое которых высвобождается и осуществляет аутолиз клетки. Таким образом, гибель клеток наступает в результате сочетания раннего подавления синтеза клеточных компонентов, накопления токсических вирусных продуктов и повреждения лизосом.

Вирусы бактерий

Бактериофаги [от «бактерии», + греч. phagein, поедать] — группа вирусов, паразитирующих в бактериальных клетках. Вирусы, вызывающие гибель инфицированных бактерий, известны как литические бактериофаги. Размножение и выход дочерних популяций вируса из бактерии сопровождается её гибелью и разрушением (лизисом). Бактериофаги широко распространены в природе — их выделяют из воды, почвы, организмов различных животных и человека. Принципы классификации бактериофагов аналогичны подходам к систематике вирусов вообще. В основу классификации положены антигенная структура, морфология фагов, спектр действия, химический состав и др. Большинство фагов относится к ДНК-вым вирусам, с нуклеокапсидом, организованным по принципу смешанной симметрии. По спектру действия выделяют типовые фаги (Т - фаги), лизирующие бактерии отдельных типов внутри вида, моновалентные фаги, лизирующие бактерии одного вида, и поливалентные фаги, лизирующие бактерии нескольких видов. Бактериофаги устойчивы к различным физическим и химическим воздействиям. Большинство из них без вреда переносит высокие температуры (50–70 °C), действие дезинфектантов (за исключением кислот и формалина), прямой солнечный свет и УФ-облучение в низких дозах. Бактериофаги проявляют иммуногенные свойства, вызывая синтез специфических АТ.

Морфология

Строение бактериофагов наиболее полно охарактеризовано на основе изучения Т-фагов кишечной палочки (рис. 5 – 10). Внешне большинство бактериофагов напоминают сперматозоиды или головастиков, но среди них встречают и другие формы, на основании которых выделяют пять основных типов бактериофагов.

Ы Вёрстка Рисунок 5 - 10

Рис. 5 – 10. Фаг Т4 кишечной палочки до контакта с бактерией (А) и в момент введения фаговой ДНК (Б).

• К типу I относят ДНК-овые нитевидные фаги, лизирующие бактерии, содержащие F-плазмиды.

• Фаги типа II представлены головкой и рудиментом хвоста. ГенЏм большинства из них образован молекулой РНК и лишь у фага jc-174 — однонитевой ДНК.

• Фаги типа III имеют короткий хвост (например, Т-фаги 3 и 7).

• К типу IV относят фаги с несокращающимся хвостом и двухнитевой ДНК (например, Т-фаги 1 и 5).

• Фаги типа V имеют ДНК-геном, сокращающийся чехол хвоста, который заканчивается базальной пластиной (например, Т-фаги 2 или 4).

Головка Т - фагов образована из однотипных субъединиц, организованных по принципу кубической симметрии, и может достигать размеров 100 нм. Капсомеры головки состоят из белковых молекул, построенных преимущественно из аспарагиновой и глутаминовой кислот, а также лизина. Содержание белка и ДНК в головке примерно одинаково. Геном большинства фагов образует спирально упакованная двойная нить ДНК. Число фагов, содержащих одноцепочечную молекулу ДНК или РНК, незначительно. У некоторых фагов (например, Т2) в головке находится внутренний белок, содержащий полиамины (спермин и путресцин) и обеспечивающий суперспирализацию большой молекулы ДНК. В таком виде она может упаковываться в сравнительно небольшом объёме. В составе фаговой ДНК обнаружены необычные азотистые основания (например, оксиметилцитозин).

Хвост Т - фагов

Хвост Т-фагов может достигать 250 нм в длину и 25 нм в ширину. Он включает полый стержень (сконструирован по принципу спиральной симметрии) и сократительный чехол, присоединяющийся к воротничку, окружающему стержень около головки. Чехол образован 120–140 белковыми молекулами, каждая из которых связывает одну молекулу АТФ и ионы Са²⁺. В дистальном отделе стержня расположена шестиугольная базальная пластина с шестью шипами и шестью нитями (фибриллами). У чётных фагов (например, у Т2) окончания фибрилл опущены вниз, а у нечётных — загнуты вверх. У некоторых Т-фагов в дистальной части хвоста находится лизоцим (эндолизин).

Размножение бактериофагов

Взаимодействие бактериофагов с клеткой специфично, так как они, как правило, инфицируют бактерии только определённого вида (рис. 5 – 11). Подобно вирусам животных, репродуктивный цикл литических бактериофагов включает адсорбцию свободного фага на клетке, инъекцию ДНК, репродукцию фага, выход дочерних популяций.

Ы Вёрстка Рисунок 5 - 11

Рис. 5 – 11. Литическое взаимодействие фага с бактериальной клеткой. Бактериофаг вводит вирусную ДНК (вДНК) в цитоплазму бактериальной клетки. Клеточные РНК-полимеразы транскрибируют ДНК в мРНК, транслирующуюся на рибосомах. В результате осуществляется синтез вирусной полимеразы и других ранних вирусных белков. Вирусная полимераза участвует в образовании вДНК дочерних популяций. Часть образовавшейся вДНК используется как матрица для синтеза белков головок и хвостов. После присоединения вДНК последние образуют дочернюю популяцию фагов.

Адсорбция. Прикрепление фага к бактерии происходит при помощи поверхностных структур бактериальной стенки, служащих рецепторами для вирусов. Например, рецепторы для фагов Т3, Т4 и Т7 расположены в липополисахаридном слое, для Т2 и Т6 — в наружной мембране. На бактериях без клеточной оболочки (протопласты, L-формы) бактериофаги не адсорбируются. Некоторые фаги в качестве рецепторов используют F-пили. Помимо рецепторов, адсорбция фага зависит от рН среды, температуры, наличия катионов и некоторых соединений (например, триптофана для Т2-фага). При избытке фага на одной клетке может адсорбироваться до 200–300 вирусных частиц.

Инъекция фага. После адсорбции происходит ферментативное расщепление клеточной стенки лизоцимом, находящимся в дистальной части отростка. Базальная пластина хвоста лизирует прилегающий фрагмент клеточной стенки, выделяя присутствующий в отростке лизоцим. Одновременно в чехле высвобождаются ионы Са²⁺, активизирующие АТФазу, что вызывает сокращение чехла и вталкивание стержня хвоста через ЦПМ в клетку. Затем вирусная ДНК «впрыскивается» в цитоплазму (внедрение вирусной ДНК). Поскольку диаметр канала лишь немного превышает диаметр молекулы ДНК (около 20 нм), то ДНК способна попадать в цитоплазму только в форме нити.

Репродукция фага. Проникнув в клетку, ДНК фага «исчезает»; уже через несколько минут обнаружить вирус не удаётся. В этот, так называемый скрытый период (љклипс) вирус берёт на себя генетическое управление клеткой, осуществляя полный цикл репродукции фага. К его окончанию составляющие фага соединяются в зрелый вирион.

Синтез фаговых белков. В первую очередь синтезируются ферменты, необходимые для образования копий фаговой ДНК. К ним относятся ДНК-полимераза, киназы (для образования нуклеозидтрифосфатов) и тимидилат синтетаза. Они появляются в клетке через 5–7 мин после её заражения. Клеточная РНК-полимераза транскрибирует вирусную ДНК в мРНК, которая транслируется бактериальными рибосомами в «ранние» белки фага, включая вирусную РНК-полимеразу и белки, способные посредством различных механизмов ограничивать экспрессию бактериальных генов. Вирусная РНК-полимераза осуществляет транскрипцию «поздних» белков (например, белков оболочки и эндолизина), необходимых для сборки фаговых частиц дочернего поколения. Некоторые вирусы расщепляют ДНК клетки-хозяина до нуклеотидов, чтобы использовать их для синтеза собственных нуклеиновых кислот.

Репликация нуклеиновых кислот реализуется за счёт активности вновь синтезированных вирусных ДНК-полимераз, производящих множественные копии вирусных нуклеиновых кислот.

Выход дочерних популяций. Вновь синтезированные белки формируют в цитоплазме пул предшественников, входящих в состав головок и хвостов дочерних вирусных частиц. Другой пул содержит ДНК потомства. Специальные аффинные области в вирусной ДНК индуцируют объединение предшественников головок вокруг агрегатов нуклеиновой кислоты и образование ДНК-содержащих головок. Заполненная головка затем взаимодействует с хвостовой частью, образуя функциональный фаг. Весь процесс (от адсорбции до появления вновь синтезированных вирусов) занимает около 40 мин. После образования потомства («урожай», или выход фага, составляет 10–200 из одной инфицирующей частицы) клетка хозяина лизируется, высвобождая дочернюю популяцию. В разрушении клеточной стенки участвуют различные факторы: фаговый лизоцим, увеличенное внутриклеточное давление. Вирус, по-видимому, также стимулирует образование аутолизинов либо блокирует механизмы, регулирующие их синтез (подобные литические факторы выявлены в фаголизатах многих бактерий).

Негативные колонии бактериофага. Размножение фагов в бактериальных культурах, засеянных сплошным «газоном» на твёрдых средах, сопровождается лизисом бактерий и образованием зон просветления — «стерильных пятен». Для их обозначения предложен термин « негативные колонии бактериофага ». У разных фагов они имеют строго определённые размеры и форму (например, звёздчатую у дизентерийных фагов). При заражении бульонных культур литическим фагом наблюдают просветление среды. Способность образовывать негативные колонии в культурах чувствительных бактерий в микробиологической диагностике возбудителей инфекционных болезней известна как фагодиагностика (рис. 5 – 12).

Ы Вёрстка! Рисунок 05 - 12

Рис. 5 - 12. Негативные колонии сальмонеллёзного (А) и дизентерийного (Б) бактериофагов. На чашках Петри, засеянных исследуемыми культурами, бактериофаги образуют негативные колонии, что указывает на род и даже вид бактерии (в зависимости от специфичности фага). При распознавании неизвестных бактериофагов учитывают форму негативных колоний. В данном случае дизентерийный бактериофаг образует характерные звёздчатые колонии.

Лизогения

В некоторых случаях вирулентных свойств фага оказывается недостаточно для разрушения бактерии. Подобные вирусы — умеренные фаги — претерпевают любопытные превращения, известные как редукция фага. При этом процессе ДНК вируса не вызывает образования вирусоспецифических белков и нуклеиновых кислот, но включается в бактериальную хромосому. С практической точки зрения бактерия приобретает новый набор генов (встроенного вируса), а также становится «иммунной» к повторному заражению (интерференция вирусов). Подобный фенЏмен известен как лизогения, а популяции бактерий — как лизогенные культуры. ДНК умеренного вируса реплицирует синхронно с размножением лизогенной бактерии, но иногда (примерно в одной из 10²–10⁵ подобных бактерий) фаг начинает спонтанно размножаться, а клетка подвергается лизису. Некоторые умеренные фаги (например, участвующие в процессах трансдукции бактерий) не способны образовывать дочерние популяции, то есть являются дефектными вирусами. Дефектные фаги используют как векторы в генной инженерии.

Вирусная ДНК может длительно сохраняться в бактериальном потомстве. Такие латентные бактериофаги известны как провирусы, или профаги.

• Сохранение способности к инфицированию у умеренного фага зависит от низкомолекулярного белкового репрессора, кодируемого вирусной ДНК и «выключающего» все вирулентные функции бактериофага.

• Переход умеренного фага на литический цикл развития происходит при нарушениях синтеза белкового репрессора. При этом встроенный в геном бактерии вирус проявляет все свои вирулентные свойства, репродуцируется и лизирует клетки, а также может инфицировать другие бактерии. Переход умеренного бактериофага в литический in vitro можно вызвать воздействием на бактерии ряда факторов. Например, если лизогенные культуры подвергнуть УФ-облучению, действию Н₂О₂ или создать в среде избыток некоторых питательных веществ и витаминов, то происходит немедленная стимуляция вирулентных свойств фага — индукция фага.

Ассоциация фаговой ДНК с геномом бактерии способна качественно изменять свойства бактериальной клетки. Например, известны различные бактерии, вирулентные свойства которых (обычно в виде экзотоксинов или адгезинов) кодируются лизогенными фагами. Иными словами, лизогенная бактерия будет вирулентной, тогда как её нелизогенный двойник останется безвредным. У других бактерий присутствие профага вызывает изменение морфологии или антигенных свойств. Такое изменение генетических свойств, вызванное вирусной ДНК, обозначают терминами «инфекционная наследственность» или «лизогенная (фаговая) конверсия». При лизогении происходит изменение наследственных свойств не только бактериальной клетки, но и фага; размножаясь в клетке, он способен захватывать некоторые гены бактерии и, инфицируя другую клетку, передаёт приобретённые гены новому хозяину. Подобная передача (трансдукция) во многом аналогична генетической рекомбинации у высших растений и животных.