Реакция нейтрализации АТ (рнат) на обнаружение АГ

В лунки верхнего ряда планшета вливают по 25 мкл разводящей жидкости. В первую лунку вносят 25 мкл исследуемого материала (АГ) и титруют по 25 мкл до предпоследней лунки, из которой 25 мкл жидкости удаляют в дезраствор. Последняя лунка – контроль диагностикума. Во все лунки добавляют по 25 мкл специфической сыворотки акттивностью 2 СЕ. Планшет выдерживают 30 мин при 37 °С и добавляют во все лунки по 25 мкл антигенного эритроцитарного диагностикума, встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 2 ч до оседания эритроцитов. Реакцию сопровождают контролем эритроцитарного диагностикума (25 мкл разводящей жидкости + 25 мкл специфической сыворотки (2 СЕ) и 25 мкл антигенного эритроцитарного диагностикума).

Если в исследуемом материале содержится АГ, то он нейтрализует 2 СЕ сыворотки, и последняя не сможет агглютинировать антигенный диагностикум (пуговка). В противном случае АТ сыворотки останутся свободными и в результате сенсибилизированные АГ эритроциты окажутся агглютинированными (зонтик). Под титром материала в РНАТ принимают крайнее разведение исследуемого АГ, при котором полностью отсутствует агглютинация эритроцитов (пуговка).

Реакция нейтрализации АГ (РНАг) на обнаружение АТ

В лунки верхнего ряда планшета вливают по 25 мкл разводящей жидкости. В первую лунку вносят 25 мкл исследуемого материала (АТ) и титруют по 25 мкл до предпоследней лунки, из которой 25 мкл жидкости удаляют в дез. раствор. Последняя лунка – контроль диагностикума. Во все лунки добавляют по 25 мкл раствора АГ в количестве 2 АЕ. Планшет выдерживают 30 мин при 37 °С и добавляют во все лунки по 25 мкл антительного эритроцитарного диагностикума, встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 2 ч до оседания эритроцитов. Реакцию сопровождают контролем эритроцитарного диагностикума (25 мкл разводящей жидкости + 25 мкл раствора АГ (2 АЕ) и 25 мкл антительного эритроцитарного диагностикума).

Если в исследуемом материале содержатся АТ, то они нейтрализуют 2 АЕ антигена, и последний не сможет агглютинировать антительный диагностикум (пуговка). В противном случае АГ останется свободным и в результате сенсибилизированные АТ эритроциты окажутся агглютинированными (зонтик). Под титром материала в РНАт принимают крайнее разведение исследуемого материала (АТ), при котором полностью отсутствует агглютинация эритроцитов (пуговка).

Реакция преципитации и ее варианты

Преципитацией называют процесс, когда происходит агрегация АТ с растворимыми АГ; если АГ представлен корпускулами, специфическая агрегация таких АГ описывается как агглютинация. Появление преципитата при реакции АГ+АТ определяется не только возникновением решетки, образуемой ее участниками, но и особой ролью Fc-фрагмента иммуноглобулина, изменение конформации которого приводит к утрате этим комплексом растворимости в солевых растворах. В связи с этим в реакции преципитации используют неразведенную или слабо разведенную сыворотку. Для постановки реакции преципитации необходимы: АТ - испытуемая сыворотка больного или иммунная диагностическая сыворотка (при идентификации выделенных микробов); АГ; физиологический раствор как источник электролитов.

Существует множество модификаций этой реакции, которые подразделяют на две группы: преципитация в жидкой среде (реакция флоккуляции и реакция кольцепреципитации) и преципитация в геле. Реакция флоккуляции представляет собой преципитацию, при которой растворы АГ и АТ смешивают в пробирке. Учет реакции производят с помощью измерения мутности получаемой системы на фотоэлектроколориметре, что позволяет определить концентрацию исследуемого АГ.

Для постановки реакции кольцепреципитации в тонкие преципитационные пробирки наливают сначала неразведенную преципитирующую сыворотку и сверху на нее наслаивают, не допуская перемешивания, раствор АГ. В случае гомологичности АТ и АГ на границе между этими растворами в течение 3-10 мин появляется кольцо преципитата. В отличие от реакции агглютинации, титр преципитирующей сыворотки определяют с помощью разведения не сыворотки, а АГ.

Реакция преципитации в геле является одним из наиболее эффективных методов анализа. Явление иммунопреципитации в геле широко используется в целом ряде важных методик, применяющихся для изучения АТ, а также для обнаружения и количественного определения растворимых АГ. Иммунопреципитация основана на очень простом принципе. В толще геля существует водная фаза, через которую легко диффундирует большинство макромолекул. Когда сложный АГ перемещается в область, содержащую АТ, то при оптимальном соотношении концентраций взаимодействующих компонентов образуются видимые линии преципитации. Реакцию обычно проводят в расположенных горизонтально тонких слоях агарового геля на стеклянных подложках.

В 1948 г. Е. Оухтерлони разработалпростой и удобный метод встречной двумерной диффузии в геле, позволяющий проводить прямое сравнение различных АГ и сывороток. Для реакций иммунодиффузии АГ и АТ вносят в лунки, вырезанные в геле напротив друг друга. Известны различные модификации метода иммунодиффузии: иммунодиффузия АГ в агаровом геле, содержащем АТ (или наоборот), приводящая к образованию колец преципитации, их диаметр пропорционален концентрации АГ (АТ); иммуноэлектрофорез -метод, объединяющий электрофоретическое разделение смеси АГ и встречную диффузию по Оухтерлони на одной и той же пластинке агарового геля. Преципитирующую сыворотку при этом наливают в канавку, вырезанную в геле параллельно направлению электрофоретического разделения. Образующиеся в результате реакции линии преципитации имеют вид дуг, вытянутых в направлении электрофоретического движения фракций АГ. Иммуноэлектрофорез позволяет определять состав сложных смесей растворимых АГ, содержащих до 30 компонентов, и является ценным диагностическим методом.