Биологические свойства холерных вибрионов

Холера – особо опасная инфекционная болезнь, с диарейным синдромом, фекально-оральным механизмом передачи возбудителя, водным, пищевым и контактно-бытовым путями распространения инфекции.

Холерные вибрионы относятся к сем. Vibrionaceae, роду Vibrio, виду Vibrio cholerae, который включает как патогенные, способные вызывать заболевания, склонные к эпидемическому и пандемическому распространению, так и свободноживущие в воде вибрионы, безопасные для человека или обусловливающие спорадические случаи диарей и инфекций с внекишечной локализацией возбудителя.

Холерные вибрионы грамотрицательные, аспорогенные полиморфные прямые или слегка изогнутые палочки, варьирующие в размерах (0,2-0,6 мкм в ширину и 1,5-3,0 мкм в длину), с одним полярно расположенным жгутиком, благодаря которому очень подвижны.

Холерные вибрионы хорошо растут на щелочных питательных средах pH 7,6-8,6, содержащих до 2% NaCl. Оптимальная температура выращивания - 35-38 ºC. На щелочных жидких питательных средах - мясо-пептонном бульоне (МПБ) и 1% пептонной воде (ПВ) - через 6-8 ч инкубирования при 37 ºC наблюдается образование нежной пленки на поверхности и легкое помутнение среды. На пластинках щелочного мясо-петонного агара (МПА) холерные вибрионы в типичной S-форме через 18-24 ч выращивания образуют гладкие, прозрачные, влажные с ровным краем колонии, диаметром 2-3 мм. Могут встречаться атипичные колонии – шероховатые, мутные, пигментированные (коричневые или желтые), коккоподобные. На элективной среде TCBS на зеленом фоне среды колонии вибрионов круглые, гладкие с ровным краем, плоские, желтого цвета. При более длительной инкубации желтый цвет колоний часто переходит в зеленый цвет.

Холерные вибрионы, как и другие представители рода Vibrio, продуцируют индофенолоксидазу, ферментируют до кислоты без газа глюкозу в аэробных и анаэробных условиях, декарбоксилируют лизин и орнитин, не обладают дигидролазой аргинина. Холерные вибрионы относятся к 1 ферментативной группе по Хейбергу: расщепляют до кислоты сахарозу и маннозу и не разлагают арабинозу. Отношение к лактозе непостоянное. Вибрионы разжижают желатину, казеин, фибрин; вырабатывают лецитиназу, липазу, нейраминидазу, хитиназу, пенициллиназу.

V.cholerae по наличию специфического O-антигена распределяются на серологические группы, их более 200. Возбудителями холеры являются холерные вибрионы O1 и O139 серологических групп. Холерные вибрионы других не O1/не O139 серологических групп могут вызывать спорадические или групповые случаи диарей, не склонные к эпидемическому распространению.

Холерные вибрионы, относящиеся к О1 серогруппе делятся на три серовара - Огава, Инаба, Гикошима. Принадлежность культур к V. cholerae О1 серогруппе устанавливают по результам агглютинации видоспецифической холерной сывороткой О1. Вариантоспецифические холерные сыворотки Огава и Инаба позволяют определить соответственно серовар культуры. Холерные вибрионы, реагирующие в одинаковых титрах с сыворотками обоих вариантов – Инаба и Огава, относятся к серовару Гикошима. Типичные штаммы холерных вибрионов в S-форме агглютинируются видо- и вариантоспецифической сывороткой не меньше, чем до 1/2 титра. Культуры в R-форме взаимодействуют с холерной RO-сывороткой, при этом агглютинация с видоспецифической холерной сывороткой О1 серогруппы снижена или отсутствует совсем.

Холерные вибрионы в пределах O1 серогруппы делятся на два биовара: классический и эльтор, имеющие существенные фенотипические и генетические отличия.

При выделении атипичных культур проводят дополнительные исследования. Штаммы, агглютинирующиеся диагностическими сыворотками О1, RО, Инаба (Огава) ниже 1/2 титра или агглютинирующиеся только RО сывороткой, с полной или частичной утратой способности лизироваться диагностическими холерными бактериофагами, изучают в тестах, определяющих их принадлежность к роду Vibrio (табл. 14). Слабоагглютинирующиеся холерной О1 сывороткой и фагорезистентные культуры исследуют также в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА), флюоресцентно-серологическим методом (МФА), реакцией иммобилизации вибрионов (РИВ) или адсорбцией по Кастеллани. Культуру, агглютинирующуюся сывороткой О139, относят к холерным вибрионам О139 серогруппы.

Если культура не агглютинируется холерными сыворотками О1, О139, но по совокупности признаков относится к виду холерных вибрионов, ее изучают в реакции агглютинации с набором диагностических холерных сывороток О2-О83 серогрупп по отечественной классификации. Кроме того, штаммы V. cholerae не О1/О139 серогрупп типируют бактериофагами диагностическими холерными ТЭПВ 1-7. Энтеропатогенные холерные вибрионы не О1 группы относятся преимущественно к О2, О5, О6, О8, О9, О14, О17, О22, О24, О28, О34, О36, О41, О42, О47, О5О серогруппам и, как правило, лизируются фагами ТЭПВ 1, 4, 7.

Таблица 14

Основные дифференциальные признаки рода Vibrio

и некоторых других микроорганизмов

Признаки	Роды сем. Vibrionaceae	Enterobacteriaceae	Pseudomonadaceae
Vibrio	Aero-monas	Enhydrobacter	Plesiomonas	Photobacterium
V.cholerae	другие виды
Окраска по Граму, морфология	Грамотрицательные полиморфные прямые или слегка изогнутые палочки
Подвижность	+	+(–)	+(–)	–	+	+	+(–)	+
Оксидаза	+	+(–)	+	+	+	+(–)	–	+(–)
Рост на средах без NaCl	+	– (+)	+	+	+	–	–	–
Чувствительность к 0- 129 ^1)	+	+(–)	–	–	+	+	–	–
О/Ф глюкозы в среде Хью-Лейфсона	+/+	+/+	+/+	+/+	+/+	+/+	+/+	+/–
Газ из глюкозы	–	– (+)	+(–)	–	–	+	+/–	–
Лизиндекарбоксилаза	+	+(–)	– (+)	+	+	+	+/–	– (+)
Орнитиндекарбокси лаза	+	+/–	– (+)	+	+	+	+/–	– (+)
Аргининдигидролаза	–	– (+)	+	+	+	+	–/+	+/–
Ферментация: лактозы	–	– (+)	– (+)	–	+	Х	+/–	– (+)
маннита	+	+(–)	+(–)	Х	–	–	+(–)	+(–)
арабинозы	–	– (+)	+(–)	Х	–	–	+(–)	– (+)
сахарозы	+	+(–)	+	Х	–	– (+)	+/–	–
инозита	–	– (+)	–	Х	+	–	– (+)	Х
Образование: ацетилметилкарбинола	+(–)	– (+)	+(–)	–	–	+	– (+)	Х
индола	+	+(–)	+(–)	–	–	–	+(–)	+/–
нитратредуктазы	+	+(–)	+	+	+	+(–)	+	+/–
b-галактозидазы	+	+(–)	+	Х	+	+	– (+)	Х
желатиназы	+	+(–)	+	Х	–	+	– (+)	+/–
Биолюминесценция	– (+)	– (+)	–	Х	–	+	–	–
Мол. % G+C в ДНК			57-63			40-44	39-59	58-70

Примечания: ¹⁾ – бактериостатический агент 2,4-диамино-6,7-диизопропилптериоидин;

Х – нет данных;

+ – положительный результат в 90 %;

- – отрицательный результат в 90 %;

+/– – положительный и отрицательный результаты встречаются в равной степени;

+(–) или –(+) – в скобках редко наблюдается результат.

 

Основными признаками дифференциации биоваров холерных вибрионов являются проба с холерными диагностическими фагами классическим и эльтор, реакция агглютинации с эритроцитами цыпленка или морской свинки, тест на чувствительность к 50 ед/мл полимиксина и образование ацетилметилкарбинола в реакции Фогес-Проскауэра (табл. 15).

Таблица 15

Дифференциальные признаки биоваров V. cholerae О1

Признаки	Биовары
V. cholerae cholerae	V. cholerae eltor
Лизабельность холерными фагами: классический	+	–
эльтор	–(+)	+/–
Агглютинация эритроцитов	–	+(–)
Чувствительность к 50 ед полимиксина	+	–(+)
Образование ацетилметилкарбинола	–	+(–)

Условные обозначения см. в таблице 14.

Холерные вибрионы являются носителями умеренных фагов с низкой литической активностью. Известны фаги, активные в отношении холерных вибрионов O1 и не O1, включая O139 серологическую группу, а также с более узким спектром литического действия, в пределах отдельных групп штаммов, например ctx⁺ и ctx¯ холерных вибрионов.

Одним из основных факторов вирулентности (и эпидемической значимости) холерных вибрионов, определяющих тяжесть клинической картины при холере, является холерный энтеротоксин, синтез которого контролируется кластером генов ctxAB.

Понятие эпидемической значимости базируется на определении комплекса показателей:

- прямые - выявление гена холерного токсина в ПЦР и определение активности его продукции на кроликах-сосунках;

- косвенные - отсутствие гемолитической, липазной активности, поздняя ферментация маннита, высокая адгезивная активность in vitro (на модели эритроцитов).

Холерные вибрионы имеют две хромосомы: большую размером 2 960 т.п.н. и малую размером 1 070 т.п.н.. На большой хромосоме V. cholerae расположены гены патогенности: ctxAB, кодирующий биосинтез CT, гены, определяющие продукцию дополнительных холерных токсинов, гены tcpA-F, кодирующие продукцию TCP, а также гены, необходимые для репликации, транскрипции, репарации ДНК, биосинтеза клеточной стенки и O-антигена. Биосинтез O1 антигена определяет кластер генов, обозначенный как wbe. Продукция O139 антигена кодируется кластером генов, также локализованном на большой хромосоме и имеющим обозначение wbf. Выявление с помощью ПЦР генов wbe и wbf, специфичных для холерных вибрионов O1 и O139 серологических групп, позволяет определить серогруппу возбудителя холеры. На малой хромосоме, помимо генов с неустановленной функцией, локализованы структурные гены hlyA, отвечающие за синтез термолабильного гемолизина, а также остров интегронов, содержащий гены, кодирующие антибиотикоустойчивость, и участвующий в приобретении новых генов. Следует отметить, что ген hlyA присутствует в хромосоме всех штаммов V. cholerae, как способных к биосинтезу термолабильного гемолизина, так и не продуцирующих этот белок. Однако в гене hlyA холерных вибрионов классического биовара, в отличие от такового V. cholerae эльтор, имеется делеция протяженностью 11 п.н., вследствие чего продукция гемолизина вибрионами этого биовара невозможна.

Штаммы холерных вибрионов O1 и O139 серогрупп, содержащие гены ctxAB и tcpA-F, вызывают холеру и являются эпидзначимыми. Эти штаммы не лизируют эритроциты барана в пробе Грейга. Эпидемически не значимые штаммы холерных вибрионов, не содержащие генов ctxAB и tcpA-F, лизируют эритроциты барана в пробе Грейга. Нетоксигенные (не содержащие гена холерного токсина) ctxAB варианты холерных вибрионов O1, также как и других серогрупп могут вызывать спорадические (единичные) или групповые (при общем источнике инфицирования) заболевания, не склонные к эпидемическому распространению.

Чувствительным и специфичным методом детекции ctxAB-оперона является генодиагностика на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР). Этот метод применяют при исследовании выделенной культуры, проб воды, испражнений больных холерой людей или сред накопления.

Наличие гена холерного токсина (ctxAB), независимо от его экспрессии, отличает токсигенные (эпидемические) от свободноживущих холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп; кроме того, в геноме токсигенных эпидемически значимых вариантов присутствует ряд генов, кодирующих синтез белка TOX T, передающего сигналы запуска синтеза холерного токсина (CT), токсинкорегулируемых пилей адгезии (TCP) и фактора колонизации (ACF). Известно, что свободноживущие атоксигенные холерные вибрионы О1 черезвычайно редко имеют tcp ген в своей хромосоме.

Токсигенные (содержащие ген холерного токсина) штаммы вызывают гибель в течение первых двух суток с типичным «синдромом холерогенности» кроликов-сосунков, зараженных 1´10⁵ и 1´10⁷ м.к. Штаммы холерных вибрионов, не содержащие гена холерного токсина, не вызывают гибели животных и изменений в кишечнике или обуславливают накопление в кишечнике выживших или павших животных мутной, коричневато-желтой жидкости, т.е. развитие энтеропатогенного синдрома, связанного с реализацией других факторов патогенности.

Обязательной проверке на модели кроликов-сосунков в отсутствии возможности определения гена холерного токсина подлежат следующие штаммы V. cholerae О1 и О139 серогрупп:

а) выделенные от людей:

- гемолизнегативные штаммы холерных вибрионов О139 серогруппы;

- гемолизпозитивные штаммы холерных вибрионов обеих серогрупп;

- гемолизотрицательные штаммы холерных вибрионов О1 серогруппы, атипичные по серологическим свойствам и устойчивые к фагу эльтор и ctx⁺;

б) выделенные из объектов окружающей среды:

- гемолизотрицательные штаммы холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп, выделенные при отсутствии эпидемических осложнений по холере.

Для полной характеристики штаммов изучают чувствительность к антибиотикам (табл. 16).

Таблица 16

Пограничные значения диаметров зон ингибиции роста (мм) и величин МПК (мкг/мл) антибиотиков в отношении Enterobacteriaceae

Антибактериальные препараты	Содержание в диске (мкг)	Диаметры зон ингибиции (мм)	МПК (мкг/мл)
Устойчивые	Промежуточные	Чувствительные	Устойчивые	Промежуточные	Чувствительные
Беталактамы
Ампициллин*		<=13	14-16	>=17	>=32		<=8
Цефотаксим		<=14	15-22	>=23	>=64	16-32	<=8
Цефтриаксон		<=13	14-20	>=21	>=64	16-32	<=8
Цефтибутен		<=17	18-20	>=21	>=32		<=8
Аминогликозиды
Канамицин		<=13	14-17	>=18	>=64		<=16
Гентамицин		<=12	13-14	>=15	>=16		<=4
Тобрамицин		<=12	13-14	>=15	>=16		<=4
Амикацин		<=14	15-16	>=17	>=64		<=16
Сизомицин		<=12	13-14	>=15	>=16		<=4
Хинолоны
Налидиксовая к-та		<=13	14-18	>=19	>=32	-	<=16
Норфлоксацин		<=12	13-16	>=17	>=16		<=4
Пефлоксацин		<=12	13-16	>=16	>=8		<=2
Офлоксацин		<=12	13-15	>=16	>=8		<=2
Ципрофлоксацин		<=15	16-20	>=21	>=4		<=1
Ломефлоксацин		<=18	19-21	>=22	>=8		<=2
Тетрациклины
Тетрациклин*		<=14	15-18	>=19	>=16		<=4
Доксициклин		<=12	13-15	>=16	>=16		<=4
Другие препараты
Хлорамфеникол*		<=12	13-17	>=18	>=32		<=4
Ко-тримоксазол*	1,25/23,75	<=10	11-15	>=16	>=4/76	-	<=2/38
Нитрофурантоин		<=14	15-16	>=17	>=128		<=32
* - методы и критерии оценки стандартизованы для холерного вибриона

 

Определение антибиотикограммы холерных вибрионов, выделенных от первых больных, необходимо проводить методом серийных разведений, поскольку этот метод позволяет диференцировать не только высокую чувствительность или высокую степень резистенстности культур к антибактериальным препаратам, но и выявлять промежуточные значения минимально-подавляющей концентрации (МПК) препарата. Дискодиффузионный метод используют как ориентировочный при изучении чувствительности к антибактериальным препаратам последующих культур холерных вибрионов.

 

ПРАКТИЧЕСКИЕ ЗАНЯТИЯ

Занятие 1.

Изучение культурально-морфологических, биохимических и серологических свойств V. cholerae cholerae и V. cholerae eltor

• Изучение характера роста культур на скошенном МПА.
• Посев агаровых культур секторами на одну чашку МПА, селективные среды (Монсура, СЭДХ и др.), пробирки со скошенным МПА, лактозо-сахарозной средой, МПБ, 1% ПВ, 0,3% полужидким агаром (ПЖА), средами Гисса с сахарозой, маннозой, арабинозой, крахмальной средой с индикатором Андреде, средой Кристенсена и желатиной.
• Посев смеси культур холерного вибриона и кишечной палочки секторами на МПА и селективные среды (Монсура, СЭДХ и др.).
• Изучение культуры в слайд-агглютинации с холерными сыворотками О1, РО, Инаба и Огава.

Слайд-агглютинацию ставят на обезжиренном стекле, помещенном в чашку Петри, используя подозрительную на холерный вибрион колонию и/или агаровую 12-18-часовую культуру и сыворотки О1 серогруппы в разведении 1:50-1:100, Инаба и Огава в разведениях 1:50. Сыворотку О139 разводят в соответствии с указанием на этикетке. Реакцию обязательно сопровождают контролями культуры в физиологическом растворе.

• Постановка с V.cholerae cholerae и V. cholerae eltor развернутой реакции агглютинации (РА), используя холерные сыворотки О1, РО, Инаба и Огава. (приложение).

Примечание:

Все посевы поместить при 37 ºС, желатину - при комнатной температуре.

Занятие 2.