Заглавная страница Избранные статьи Случайная статья Познавательные статьи Новые добавления Обратная связь КАТЕГОРИИ: АрхеологияБиология Генетика География Информатика История Логика Маркетинг Математика Менеджмент Механика Педагогика Религия Социология Технологии Физика Философия Финансы Химия Экология ТОП 10 на сайте Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрацииТехника нижней прямой подачи мяча. Франко-прусская война (причины и последствия) Организация работы процедурного кабинета Смысловое и механическое запоминание, их место и роль в усвоении знаний Коммуникативные барьеры и пути их преодоления Обработка изделий медицинского назначения многократного применения Образцы текста публицистического стиля Четыре типа изменения баланса Задачи с ответами для Всероссийской олимпиады по праву Мы поможем в написании ваших работ! ЗНАЕТЕ ЛИ ВЫ?
Влияние общества на человека
Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрации Практические работы по географии для 6 класса Организация работы процедурного кабинета Изменения в неживой природе осенью Уборка процедурного кабинета Сольфеджио. Все правила по сольфеджио Балочные системы. Определение реакций опор и моментов защемления |
Приготовление амплификационной смеси и поставка ПЦР.На одну пробу необходимо: - 2 мкл 10х ПЦР-буфера; - 1,5 мкл 2,5 мМ раствора дНТФ; - 1,5 мкл 25 мМ MgCl2; - по 10 pmol каждого праймера (обычно по 0,5-1 мкл). Для оценки эпидзначимости штаммов используют два праймера для детекции ctx AB: P1 5¢ - TGA AAT AAA GCA GTC AGG TG – 3¢ P3 5¢ - GGT ATT CTG CAC ACA AAT CAG - 3¢ -для детекции tcp A: В реакцию взять эквимолярное количество праймеров. Расчет концентрации провести в зависимости от оптической плотности и количества оснований в олигонуклеотидах по следующей формуле: C (pmol/m1)= A260 / (0,01хN), где: A260 - поглощение раствора праймера при 260 нм; N - число оснований в одном праймере; 0,2 мкл Taq-ДНК-полимеразы; стерильной бидистиллированной воды до 22 мкл (в зависимости от количества вносимых праймеров). Приготовить общую амплифицированную смесь и две пробы (положительный и отрицательные контроли), перемешать пипетированием и внести в амплификационные пробирки по 22 мкл в каждую. Исследуемые образцы в количестве 3 мкл внести в соответствующие пробирки с амплификационной смесью, используя отдельные наконечники для каждого образца, после чего смесь перемешать пипетированием и наслоить 40-50 мкл вазелинового масла (три капли из наконечника объемом 200 мкл). В качестве положительного контроля применить 3 мкл образца ДНК, экстрагированной методом кипячения из суспензии клеток штамма V.cholerae eltor М-878, с концентрацией 1х107 КОЕ/мл. В качестве отрицательного контроля использовать 3 мкл дистиллированной воды. Амплификацию проводить в термоциклере по следующей программе: стартовая денатурация 94 ºС - 2 мин далее 35 циклов 94 оС - 45 сек 57 оС - 45 сек 72 оС - 45 сек заключительная элонгация 72 оС - 10 мин Примечания: Солевой ПЦР-буфер, раствор дНТФ, раствор MgCl2, праймеры, Taq-ДНК-полимеразу хранят при -10 оС или -20 оС и размораживают (кроме Taq-ДНК-полимеразы) только перед приготовлением амплификационной смеси; Учет результата амплификации. По окончании программы амплификации анализируемые образцы смешать с 2-2,5 мкл раствора для нанесения проб и внести в лунки горизонтального агарозного геля плотностью 1,3 %. Электрофорез проводить в 1х ТВЕ-буфере в присутствии бромистого этидия в концентрации 0,5 мкг/мл, при напряженности 6 В/см в течение 1 ч, не допуская выхода красителя бромфенолового синего из геля. Затем - просмотр геля в ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе. Амплифицированные фрагменты идентифицируют по размеру, сравнивая флюоресцирующие в геле полосы анализируемых образов с полосами положительного контроля или в соответствии с маркерами молекулярного веса. Оценка результатов: В случае обнаружения в одной пробе амплифицированных фрагментов размером 777 н.п. (ctxAB оперон), соответствующий штамм расценивается как эпидемически опасный. Проба с отрицательным контролем не должна иметь флюоресцирующих фрагментов в геле. Занятие 5. Изучение чувствительности V. cholerae cholerae и V. cholerae eltor к антибиотикам · Опредение чувствительности культур к антибиотикам методом диффузии в агаре, используя 18-20-часовую бульонную культуру. · Определение чувствительности культур к тетрациклину методом серийных разведений в жидкой питательной среде, используя 18-часовую бульонную культуру. Занятие 6. Изучение чувствительности V. cholerae cholerae и V. cholerae eltor к антибиотикам · Учет результата изучения чувствительности культур к антибиотикам по зонам задержки роста вокруг дисков антибиотиков. · Определение чувствительности (устойчивости) культур к антибиотикам методом диффузии в агаре по таблице 16. · Учет результата изучения чувствительности культур к тетрациклину методом серийных разведений в жидкой среде. Определение МПК антибиотика в отношении изучаемых культур. Оценка результата по таблице 16. Занятие 7.
|
||
Последнее изменение этой страницы: 2016-12-30; просмотров: 534; Нарушение авторского права страницы; Мы поможем в написании вашей работы! infopedia.su Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. Обратная связь - 3.149.252.37 (0.003 с.) |