Исследование испражнений больного с типичной клиникой

· Применение МФА:

Приготовление из нативного материала мазка, обработка его люминесцирующей холерной сывороткой и просмотр. Через 1,5-2 ч - предварительный ответ.

· Посев нативного материала по 0,1 мл в 5-8 мл 1 % ПВ и на 4 чашки МПА. Через 3, 4, 5, 6 ч инкубирования при 37 ºС приготовление мазков с 1 % ПВ и чашек (путем смыва физиологическим раствором), обработка их люминесцирующей холерной сывороткой и просмотр. Через 3–6 ч при нарастании количества специфически «окрашенных» вибрионов, определяемых в мазках, - ответ о наличии возбудителя холеры в исследуемом материале.

· Исследование нативного материала в РИВ под влиянием холерных сывороток 01 (разведение 1: 100), Инаба и Огава (разведении 1: 50). Через 15-20 мин - предварительный ответ.

· Исследование нативного материала в РА в 1 % ПВ и в пробе с диагностическими холерными бактериофагами классическим и эльтор:

- добавление 2-3 капель исследуемого материала в разведенные 1 % ПВ в объеме 1 мл холерные сыворотки О1, Инаба, Огава (с 1: 100 до титра) и контроль антигена (1 мл 1 % ПВ). Контроль сыворотки: 1 мл сыворотки в разведении 1: 100 (без исследуемого материала). Учет реакции агглютинации через 1 ч. При положительном результате виден агглютинативный рост с просветлением среды при отсутствии агглютинации в контрольной пробирке. При отрицательном результате – гомогенное помутнение среды (наблюдение вести в течение 3 часов).

· Постановка пробы с холерными фагами классическим и эльтор двуслойным методом, внося в 5 мл расплавленного и охлажденного 0,7 % ПЖА 0,5 мл исследуемого материала (приложение). Учет фаголизиса через 1,5-2 ч инкубирования.

· При положительных результатах РА, фаголизиса и данных микроскопии - окончательный ответ.

· Постановка микрометодом РПГА и РТПГА с холерным иммуноглобулиновым эритроцитарным диагностикумом. Исследуемый материал предварительно прогреть в течение 20 мин при 100 ºС. Через 2 ч - предварительный ответ.

· Применение мультиплексного ПЦР-анализа нативного материала от больного холерой (занятие 4).

· Посев исследуемые испражнения в 5-8 мл 1 % ПВ и на пластинку МПА для выделения культуры и ее изучения.

Занятие 13

Исследование воды:

Работа по плану занятия 10.

Ускоренная идентификация культуры по основным признакам

· Просмотр чашки МПА с посевом испражнений больного (предыдущее занятие), отбор подозрительных на рост вибрионов колоний.

· Микроскопия мазков, постановка ОРА с подозрительными колониями, используя агглютинирующую холерную 01 сыворотку.

· При положительной ОРА отсев колонии в 3 мл МПБ и после 3 ч инкубации изучение следующих признаков:

- агглютинабельности в пределах титра с холерными сыворотками О1, Инаба и Огава, разведенными 1 % ПВ в объеме 1 мл (занятие 12).

- чувствительности к холерным фагам классическому и эльтор.

- ферментации сахарозы, маннозы, арабинозы с использованием среды в объеме 0,5-1 мл. Закапывание во все пробирки по 1 капле изучаемой культуры.

· Учет результатов через 3-6 ч инкубирования посевов при 37 ºС. При наличии четких положительных результатов - окончательный ответ о выделении возбудителя холеры.

Занятие 14

Исследование воды:

· Учет результатов изучения выделенной культуры.

· По результатам изучения культуры - окончательный ответ.

Серологическая диагностика

Серологические методы исследования, как правило, имеют дополнительное значение, и лишь в отдельных случаях при проведении оперативного и ретроспективного эпидемиологического анализа их результаты могут быть решающими.

Для серологической диагностики холеры используют иммунологические реакции, выявляющие в сыворотке крови больных, переболевших и вибриононосителей, а также вакцинированных специфические антитела: агглютинины, антитоксины и вибриоцидные антитела. Исследуют парные сыворотки с интервалом 7-10 дней. Первую пробу берут на 5-7 день болезни. В лаборатории сыворотки инактивируют при 56 ºС в течение 30 мин и при необходимости сохраняют при 4 ºС.

Агглютинины у больных холерой появляются на 5-7 день заболевания и максимального титра достигают к 14-15 дню от начала заболевания. Затем их титр постепенно снижается.

Агглютинины в сыворотке крови больного холерой определяют в объемной реакции агглютинации. В качестве антигена используют живую культуру, выделенную в очаге холеры, или диагностикумы - клетки холерных вибрионов, убитые кипячением или формалином. Диагностическое значение имеет четырехкратный и более высокий подъем титров антител при исследовании парных сывороток. Противохолерные антитела можно выявить методом фазово-контрастной микроскопии, используя в качестве индикаторного штамма культуру холерного вибриона, выделенную в данном очаге, или музейный штамм того же биовара и серовара. Кроме того, можно поставить реакцию нейтрализации антигена (РНАг) с холерным иммуноглобулиновым эритроцитарным диагностикумом и РНГА с антигенным холерным эритроцитарным диагностикумом.

Вибриоцидные антитела в крови больных холерой в титрах 10^-1-10^-3 обнаруживают с 1–3 дня болезни. Вибриоцидины достигают максимального значения (10^-4-10^-8) к 10-12 дню, а к 30 дню болезни быстро снижаются. У переболевших, вибриононосителей и вакцинированных титр вибриоцидных антител колеблется от 10^-1 до 10^-8.

Для выявления вибриоцидных антител предложен ряд методов, основанных на том, что в присутствии вибриоцидных антител в сыворотке не происходит размножение холерных вибрионов. Наиболее простыми и быстрыми являются методы, разработанные Домарадским И.В., Ерохиным Е.П. (1971), Наумшиной М.С. и др. (1973). Определение вибриоцидных антител этими методами основано на ферментации углеводов. О наличии или отсутствии вибриоцидных антител судят по разложению сахарозы, регистрируемому с помощью индикатора. В практических лабораториях для определения вибриоцидных антител также применяют микрометод Бененсона и др. (1968), макро- и микрометод с использованием диагностикума холерного эритроцитарного О-иммуноглобулинового.

В сыворотках крови больных холерой, вибриононосителей и привитых холероген-анатоксином можно выявлять антитела к энтеротоксину холерного вибриона. Титр антитоксинов нарастает медленно и достигает максимального значения к концу 2-ой недели заболевания.

Для определения токсиннейтрализующих антител разработан ряд методов in vivo и in vitro. Наиболее трудоемкими являются методы с использованием животных: 10-дневных крольчат, изолированных петель взрослых кроликов, белых мышей. В практической работе целесообразно ставить РНГА с эритроцитарным холерным энтеротоксическим диагностикумом (ЭХЭД). Диагностическим титром РНГА с ЭХЭД следует считать 1:160. Целесообразно исследовать парные сыворотки. Для определения токсиннейтрализующих антител можно использовать также реакцию преципитации в геле, встречный иммуноэлектрофорез, пробу Крейга.

Занятие 15