Лабораторная диагностика туляремии

Лабораторная диагностика туляремии осуществляется в соответствии с методическими указаниями «Эпидемиологический надзор за туляремией» МУ 3.1.2007–05 и основана на комплексном подходе, направленном на выявление как живых бактерий, так и специфических агентов или специфичнеских антител против туляремийного микроба. Однако эффективность диагностики во многом зависит от правильности сбора и доставки исследуемого материала.

При проведении лабораторной диагностики исследуют:

– от больных людей: содержимое бубона, материал из зева, коньюнктивы глаза, отделяемое язвы, мокроту, кровь и сыворотку крови;

– от умерших людей: увеличенные лимфатические узлы, измененные участки легких и селезенки;

– при эпизоотологическом обследовании: диких млекопитающих или их трупов, подснежные гнезда грызунов, продукты жизнедеятельности млекопитающих, погадки птиц, помет хищных млекопитающих, а также солому, мякину, талую воду и другие объекты, загрязненные выделениями грызунов, воду из естественных водоемов и колодцев, гидробионтов, членистоногих (преимущественно иксодовых клещей), мелких эктопаразитов, собранных с млекопитаюих (вшей, гамазовых и краснотелковых клещей, блох). При трансмиссивных вспышках исследуют кровососущих двукрылых (комаров, слепней и др.). Серологические исследования сывороток крови домашних животных проводят при соответствующих эпизоотологических и эпидемиологических показаниях.

При исследовании на туляремию в лабораторию поступает патологический материал от больных или переболевших людей, домашних животных, погадки хищных птиц, кровососущие членистоногие (клещи, блохи, вши, комары, слепни и т.д.), объекты окружающей среды (вода, пищевые продукты, зерно, фураж и т.д.).

Лабораторная диагностика туляремии базируется на серологических (МФА, ИФА, реакция агглютинации, реакция непрямой гемагглютинации, реакция нейтрализации антител), молекулярно-генетических (ПЦР), бактериологических (бак бактериоскопия, посевы на питательные среды), биологических (заражение биопробных животных) и аллергических методах исследования.

Лабораторная диагностика туляремии у людей базируется, главным образом, на сероаллергических методах. Из аллергических методов используют накожную и внутрикожную пробу с тулярином, реакцию лейкоцитолиза. Из серологических реакций ставят реакцию агглютинацию (РА), микрореакцию агглютинации с цветным туляремийным диагностикумом, реакцию непрямой гемагглютинации (РНГА), кровяно-капельную реакцию. Бактериологические методы не всегда эффективны, что определяется особенностями течения инфекции у человека, малой обсемененностью органов и тканей возбудителем. Выделение возбудителя наиболее вероятно в течение первых 2–3 недель от начала заболевания и реже в более поздние сроки. В эти же сроки с материалом от больного человека ставят ПЦР.

Домашних животных на туляремию исследуют иммунологическими методами.

При эпизоотологическом обследовании территорий, существенную роль играют серологические методы исследования, позволяющие с меньшими трудозатратами и в короткий срок дать заключение об эпизоотическом состоянии территории. В последние годы находит применение высокочувствительный метод ПЦР, позволяющий по обнаружению специфической ДНК судить о наличии возбудителя туляремии в пробе и выявлять «некультивируемые» формы микроорганизма. В практике эпизоотологического исследования на туляремию основное место принадлежит бактериологическим методам, обеспечивающим выявление и выделение возбудителя. Отловленных с одной территории животных вскрывают, группируют по 5–10 особей и включают в одну биологическую пробу. При групповом анализе мазки и посевы от каждого зверька не делают. Для серологического исследования от грызунов, отловленных живыми, берут кровь из сердца на обнаружение антител к туляремийному микробу.

Животных, у которых на вскрытии обнаружены характерные для туляремии патологоанатомические изменения, исследуют индивидуально. Просматривают окрашенные по Романовскому-Гимза и обработанные люминесцентной сыво сывороткой мазки-отпечатки из органов. Производят посевы органов на плотные питательные среды. Забирают материал для серологического исследования на обнаружение туляремийного антигена (РНГА, РНАт реакция кольцепреципитации) и на обнаружениие специфической ДНК (ПЦР). Ставят индивидуальную биопробу.

Животных, погибших в природе, исследуют индивидуально. Органы трупа, если они не подверглись сильному разложению, засевают на плотные питательные среды с антибиотиками, готовят мазки-отпечатки и заражают биопробных животных. Параллельно ставят серологические реакции на обнаружение туляремийного антигена, ПЦР на обнаружение специфической ДНК. Если на исследование поступает труп грызуна, с выраженными процессами гниения, посевы на питательные среды не делают, а ограничиваются накожным или подкожным заражением белых мышей. В некоторых случаях от трупа исследуют только костный или головной мозг. Павших биопробных животных немедленно вскрывают. Выживших – хлороформируют (белых мышей на 15 сутки, морских свинок на 25 сутки) и делают посев селезенки на свернутую желточную среду.

Кроме грызунов, биологическим методом исследуют добытых в природе и снятых с грызунов кровососущих членистоногих и других беспозвоночных животных. Иксодовых клещей объединяют до 50 экземпляров в одну биологическую пробу. Гамазовых клещей, блох, вшей сортируют по родам, видам и группируют в отдельные пробы. Комаров объединяют до 100, мошек до 250, слепней по 25–50 экземпляров на одну биопробу.

Объекты окружающей среды также исследуют биологическим методом. Непосредственный посев материала на питательные среды не эффективен в виду его незначительной обсемененности возбудителем и загрязнением посторонней микрофлорой, подавляющей рост микроба туляремии. В этом случае можно использовать высокоселективные среды с антибиотиками. Идентификацию возбудителя туляремии проводят на основании следующих признаков:

§ морфологии и окраски микроба в мазках;

§ специфического свечения в МФА;

§ характера роста на плотных питательных средах;

§ отсутствия роста на простых питательных средах (МПА, МПБ);

§ РА со специфической туляремийной сывороткой;

§ выявление родоспецифичной ДНК в ПЦР;

§ патогенности для лабораторных животных (белые мыши, морские свинки).

Культура должна иметь характерный для микроба туляремии рост на плотных питательных средах (Мак-Коя, Анциферова, FT–агаре и др.), не расти на простых питательных средах (кроме F. tularensis subsp. novicida), агглютинироваться диагностической туляремийной сывороткой до титра или до 1/2 титра, вызывать гибель биопробных животных. Выделенные штаммы желательно типировать до подвида и дифференцировать на биологические варианты.

К серологическим методам диагностики туляремии относятся:

- реакции, направленные на выявление антител к туляремийному микробу (кровяно-капельная, РА, РНГА, РТНГА и др.);

- реакции, направленные на выявление антигенов туляремийного микроба (РНАт, кольцепреципитации, МФА, РА, РНГА, РТНГА и др.).

Серологические реакции используют для обследования и выявления природных очагов туляремии, для диагностики туляремии у людей. С целью рекогносцировочного обследования значительных территорий используют реакции, направленные на выявление антигенов туляремийного микроба в исследуемом материале.

Серологически исследуют материал, который не содержит живых туляремийных бактерий и непригоден для бактериологического исследования: от диких позвоночных животных, погадки хищных птиц, помет хищных млекопитающих, субстраты гнёзд грызунов, почву и т. д.

На антитела к туляремийному микробу исследуют сыворотки грызунов, добытых при эпизоотологическом обследовании территории, сельскохозяйственных животных, больных или переболевших туляремией людей.

К аллергическим методам относится:

- реакции in vivo – внутрикожная и накожная туляриновые пробы;

- реакции in vitro – лейкоцитолиза, показатель повреждения нейтрофилов (ППН), бласттрансформации и др.

Экспрессные и ускоренные методы поиска антигена (РА, РHГА, РТHГА, реакции кольцепреципитации, МФА, ИФА) в исследуемом материале или антител к нему (РНАт, РА, РНГА, РТНГА, кровяно-капельная реакция, МФА, ИФА), а также обнаружение специфической ДНК возбудителя (ПЦР) позволяют получить результат в течение 2–5 ч.

При использовании экспрессных и ускоренных методов диагностики получают лишь предварительный результат, который должен быть подтвержден выделением чистой культуры возбудителя туляремии.

Современные методы исследования позволяют быстро и в определенной степени надежно поставить диагноз туляремии у человека и осуществить выявление возбудителя при обследовании территорий.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ЗАНЯТИЯ

Занятие 3

Исследование грызунов:

• Вскрытие трупа грызуна:

- изучение патологоанатомических изменений внутренних органов;

- приготовление и исследование мазков-отпечатков из органов трупа грызуна, обработанных туляремийной люминесцирующей сывороткой;

- исследование в реакции кольцепреципитации суспензии органов (печень, селезенка) трупа грызуна;

- постановка из суспензии внутренних органов трупа грызуна индивидуальной биологической пробы (п/к заражением белых мышей);

• Вскрытие отловленного грызуна с патологоанатоми патологоанатомическими изменениями во внутренних органах, характерных для туляремии:

- изучение патологоанатомических изменений во внутренних органах грызуна;

- приготовление и просмотр мазков-отпечатков из органов грызуна, окрашенных по Романовскому-Гимза;

- посев на среды Мак-Коя и Анциферова лимфатического узла, крови, печени, селезенки;

- постановка из суспензии внутренних органов грызуна индивидуальной биологической пробы (п/к заражением белых мышей);

• Вскрытие отловленных грызунов без патологоанатомических изменений во внутренних органах:

- постановка из суспензии внутренних органов грызунов биологической пробы (п/к заражением белых мышей).

Примечания:

- работа по заражению и вскрытию животных проводится курсантами в лаборатории экспериментальных животных;

- методы исследования диких грызунов отрабатываются на заранее зараженных возбудителем туляремии белых мышах;

- павших биопробных животных вскрывают немедленно.

Исследование воды:

Вскрытие морской свинки, зараженной подкожно исследуемой водой:

- изучение патологоанатомических изменений во внутренних органах;

- приготовление и исследование мазков-отпечатков из внутренних органов морской свинки, обработанных туляремийной люминесцирующей сывороткой;

- посев печени, селезенки и пахового лимфатического узла на среды Мак-Коя и Анциферова.

Примечание: морскую свинку курсанты заражают исследуемой водой заранее с учетом сроков гибели.

Занятие 4