Исследование материала для выявления днк возбудителя туляремии с использованием пцр

Занятие включает три последовательных этапа, которые выполняются в течение одного полного учебного дня.

Для постановки реакции используется тест-система, разработанная в Российском научно-исследовательском противочумном институте «Микроб». Тест-система предназначена для выявления возбудителя F. tularensis в клиническом материале и объектах внешней среды при помощи системы праймеров, комплементарных участку гена, кодирующего белок молекулярной массой 23 kD. Принцип реакции заключается в многократно повторяющихся циклах синтеза (амплификации) специфичной области ДНК-мишени в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы, дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ), соответствующего солевого буфера и олигонуклеотидных затравок – праймеров, определяющих границы амплифицируемого участка ДНК. Каждый цикл включает в себя три стадии с различными температурными режимами. На первой стадии при 94 ^оС происходит разделение цепей ДНК, затем при 53 ^оС – присоединение (отжиг) праймеров к гомологичным последовательностям на ДНК-мишени, на третьей стадии при температуре 72 ^оС – синтез новых цепей ДНК путём удлинения праймеров в направлении 5’ – 3’ конца. В каждом цикле происходит удвоение числа копий амплифицируемого участка, ограниченного парой выбранных праймеров, что позволяет за 35 циклов наработать ДНК в количестве, достаточном для её детекции с помощью электрофореза.

Материалом для исследования могут быть пробы от больного (пунктат из бубона, соскоб из зева, отделяемое из глаза и др.), пробы из окружающей среды (вода, смывы, суспензии органов грызунов, кровь, кровососущие членистоногие и др.), бактериальные культуры. Отбор проб осуществляется с соблюдением правил асептики, стерильным инструментом в одноразовые ёмкости. Обеззараживание материала, подлежащего исследованию, проводят согласно МУ 3.5.5-1034-01 мертиолятом натрия (1:10000) с последующей обработкой лизирующим буфером с гуанидинтиоцианатом и прогреванием при 65 ^оС в течение 15 мин.

Пробы крови, содержимого бубона, мазков из зева и с коньюктивы глаза, отделяемого язвы исследуют без предварительной подготовки, отбирая для анализа по 0,1 мл нативного материала в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.

К мокроте (1–2 мл) добавляют равный объем приготовленной ex temporeсмеси NALC (0,25 г N-ацетил-L-цистеина, 25 мл 4% раствора NaOH, 25 мл 0,1 М тризамещенного цитрата натрия или набор Муколизин, ИнтерЛабСервис). Перемешивают покачиванием в течение 20–30 с. Смесь инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре, а затем разводят 0,067 М фосфатным буфером (рН 6,8) до 50 мл. Центрифугируют в течение 15 мин при 10000 об/мин. Осадок используют для выделения ДНК.

Кусочки органов массой до 10 г растирают в стерильной ступке со стеклянным порошком, после чего добавляют 0,9 % раствор натрия хлорида в соотношении 1:5 (вес/объем). Надосадочную жидкость отбирают с помощью пипетки через ватный тампон в отдельную пробирку. Центрифугируют в течение 15 мин при 12000 об/мин, осадок суспендируют в физиологическом растворе и используют для выделения ДНК. Подготовку гидробионтов осуществляют аналогичным образом.

Блох перед исследованием усыпляют эфиром, нанося каплю эфира на ватно-марлевую пробку. Ссыпают в стерильную ступку, куда вносят 0,5 мл 0,9% раствора натрия хлорида и растирают. Затем с помощью пипетки через ватный тампон в отдельную микропробирку отбирают надосадочную жидкость, из которой проводят выделение ДНК.

Пробы клещей, объединенных по 5–50 шт., комаров, объединенных по 50–100 шт. (в зависимости от вида, точки сбора, упитанности и т.д.), растирают в охлажденной стерильной фарфоровой ступке с 0,5–1,0 г охлажденного стерильного стеклянного порошка, добавляют 1–2 мл охлажденного 0,9 % раствора натрия хлорида. Затем переносят по 1,0 мл жидкой фазы в пластиковые микропробирки объемом 1,5 мл. Подготовленные образцы центрифугируют при 12000 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость используют для выделения ДНК, для чего отбирают 0,1 мл образца.

Отобранные навески соломы и мякины измельчают при помощи ножниц и пинцета на листе бумаги, затем помещают в банки. К исследуемому материалу добавляют 0,9 % раствор натрия хлорида 1:10, тщательно перемешивают в течение 15 мин, отстаивают в течение 10 мин для оседания крупных частиц. Надосадочную жидкость дробно центрифугируют: первоначально в течение 2–3 мин при 5000 об/мин, затем супернатант центрифугируют в течение 15 мин при 12000 об/мин. Осадок суспендируют в 0,2–0,5 мл дистиллированной воды. Подготовку гнезд грызунов осуществляют аналогичным образом.

Пробы погадок птиц и помета хищных млекопитающих суспендируют в физиологическом растворе из расчета 1:9 (1 часть пробы + 9 частей физиологичесого раствора). Для исследования отбирают 1 мл суспензии и переносят в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Пробирки центрифугируют при 5000 об/мин в течение 5 мин. Отдельным наконечником с аэрозольным барьером из каждой пробирки отбирают надосадочную жидкость и переносят в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл. Затем центрифугируют при 12000 об/мин в течение 15 мин, надосадочную жидкость удаляют. Осадок ресуспендируют в 0,1 мл 0,9% раствора натрия хлорида и используют для исследования.

Пробы воды открытых водоемов объемом 1,0 л дробно центрифугируют. Первоначально в течение 15 мин при 10000–12000 об/мин. Полученный осадок ресуспендируют в 0,5 мл физиологического раствора, помещают в микроцен трифужную пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируют при 2000–5000 об/мин в течение 1 мин. Надосадочную жидкость отбирают наконечником с аэрозольным барьером в микропробирку объемом 1,5 мл. Для выделения ДНК используют 0,1–0,2 мл надосадочной фракции.

Для проведения амплификации готовят необходимое количество микропробирок V-0,6 мл, соответствующее числу проб, а также две микропробирки для положительного и отрицательного контролей. Реакционную смесь готовят в отдельной пробирке из рассчёта на одну пробу: Н₂О – 7,0 мкл, 10ХБ – 2,5 мкл, дНТФ – 2,5 мкл, МgCl₂ – 1 мкл, праймеров FT23s1 и FT23a1 – по 1 мкл каждого, фермента Taq-полимеразы – 0,2 мкл. Во все пробирки вносят по 15 мкл реакционной смеси и добавляют 30 мкл (1 капля) минерального масла. Все манипуляции осуществляют при 4–5 ^оС.

В соответствующие пробирки для проведения амплификации, используя одноразовые наконечники, вносят под масло по 10 мкл подготовленных проб. В пробирку, помеченную как положительный контроль, вносят 2 мкл контрольной ДНК (1 нг/мкл) и 8 мкл Н₂О; в отрицательный контроль – 10 мкл Н₂О. Все подготовленные микропробирки центрифугируют 20 сек при 2000 об/мин и помещают в амплификатор. Проводят ПЦР в следующем температурном режиме: денатурация при 94 ^оС в течение 3 мин; затем 35 циклов: 94 ^оС – 40 сек, 53 ^оС – 40 сек, 72 ^оС – 40 сек, в заключение проводят дополнительный цикл при 72 ^оС в течение 5 мин.

Продукты ПЦР анализируют методом гель-электрофореза в 1,5% агарозе, которую готовят на ТАЕ-буфере с бромистым этидием (состав ТАЕ-буфера: трис-НСl – 4,84 г; ледяная уксусная кислота – 1,2 мл; раствор ЭДТА в концентрации 0,5 М; бромистый этидий – до конечной концентрации 0,5 мкг/мл, общий объём доводят дистиллированной водой до 1 литра, рН 8,0).

К 10–20 мкл ПЦР-продукта добавляют 1–2 мкл 10-кратного буферного раствора, содержащего: бромфеноловый синий – 0,25%, фиколл – 25% в дистиллированной воде. Подготовленные смеси вносят в лунки агарозного геля.

Окрашенный бромистым этидием гель просматривают под ультрафиолетовым излучением, для чего используют трансиллюминатор с максимальной длиной волны 254 нм. Анализируемые фрагменты проявляются в виде светящихся розово-красных полос.

При оценке результатов в отрицательном контроле полосы должны отсутствовать, в положительном контроле выявляется полоса фрагмента размером 548 н.п., в анализируемых пробах отсутствие полосы строго на уровне положительного контроля свидетельствует об отрицательном ответе, а наличие полосы, соответствующей по электрофоретической подвижности положительному контролю – свидетельствует о наличии в пробе ДНК F. tularensis.