Биологические свойства возбудителя сибирской язвы

Сибирская язва является острым инфекционным заболеванием человека и животных (домашних и диких).

Основным источником инфекции при сибирской язве являются больные травоядные животные. Они в течение всего периода болезни выделяют возбудителя с мочой, испражнениями и слюной в почву, инфицируя ее, поэтому почва, особенно богатая органическими веществами, становится дополнительным резервуаром возбудителя. Заражение животных происходит главным образом элементарным путем (через корм и питьевую воду, зараженные спорами), реже – трансмиссивным – через укусы кровососущих насекомых и воздушным путем.

Заражение человека сибирской язвой происходит при непосредственном контакте с трупами погибших животных, при разделке туш вынужденно убитых животных, при уходе за больными животными, при употреблении мяса или мясных продуктов, полученных от больных животных, при контакте с шерстью, шкурами, кожей, щетиной, зараженными возбудителем или его спорами.

Возбудитель сибирской язвы Bacillus anthracis относится к семейству Bacillaceae, роду Bacillus. Это крупная палочка длиной 5-8, иногда до 10 мкм, диаметром 1,0–1,5 мкм. Концы у живых палочек слегка закруглены, у убитых они как бы обрублены и слегка вогнуты. Палочки в мазках располагаются цепочками напоминая бамбуковую трость. Сибиреязвенная палочка хорошо красится всеми анилиновыми красителями, грамположительна. Жгутиков не имеет, образует споры, но только вне организма человека или животного при наличии кислорода и определенной влажности. Оптимум для спорообразования 30-35 ºС (ниже 12 ºС и выше 43 ºС спорообразования не происходит). Споры располагаются центрально, их диаметр не превышает диаметра бактериальной клетки. Образование спор происходит в тех случаях, когда бактерии испытывают дефицит источников энергии. Поскольку в крови и тканях источники питания бактерий имеются, спорообразования в организме не происходит. Возбудитель сибирской язвы образует капсулу (рис.21), но только в организме животного и человека или на специальных питательных средах. Капсулообразование патогенных бактерий – защитный механизм.

 

 

Рис.21. Каспула возбудитель сибирской язвы Bacillus anthracis

Возбудитель сибирской язвы – аэроб или факультативный анаэроб. Температурный оптимум для роста 37 – 38ºС, рН среды 7,2 – 7,6. К питательным средам не требователен. На плотных средах образует характерные крупные матовые шероховатые колонии R-формы. Структура колоний, благодаря цепочечному расположению палочек, которые образуют нити, отходящие от центра, имеют сходство с локонами или львиной гривой (рис.22).

 

 

 

Рис.22. Морфология колонии Bacillus anthracis.

 

На агаре и в бульоне, содержащем пенициллин (0,05 – 0,5 ЕД/мл), через 3 ч инкубации бациллы образуют цепочки из шарообразных клеток - феномен «жемчужного ожерелья». В бульоне палочка, находящаяся в R-форме, растет на дне, образуя осадок в виде комочка ваты, бульон при этом остается прозрачным. B. anthracis вирулентна в R–форме, при переходе в S-форму она утрачивает свою вирулентность. Такие палочки на плотной среде образуют круглые гладкие колонии с ровными краями, а в бульоне – равномерное помутнение. При этом палочки утрачивают способность располагаться в мазках цепочками и приобретают вид коккобактерий.

Основные свойства, выделяющие сибиреязвенный микроб в отдельную систематическую единицу и обусловливающие патогенез заболевания, заключаются в его факторах патогенности – способности клетки синтезировать сложнокомпонентный экзотоксин и капсулу – полипептид d-глутаминовой кислоты. Гены, кодирующие синтез экзотоксина и капсулы, локализованы на плазмидах РХ О1 и РХ О2 м.м. 110 и 60 мДа, соответственно. У близкородственных бацилл эти плазмиды не обнаружены. Токсин, секретируемый B. anthracis,состоит из трех белковых компонентов, биологическая активность которых проявляется при их сочетанном действии. Согласно принятой классификации, компоненты токсина обозначены как отечный фактор (ОФ), протективный антиген (ПА) и летальный фактор (ЛФ). Установлено, что ОФ является ферментом - аденилатциклазой (цАТФ пирофосфатлиаза), который в неактивной форме продуцируется бактериальной клеткой и способствует повышению уровня цАМФ более чем в 200 раз. Активация аденилатциклазы в клетках макроорганизма происходит под воздействием Са-связывающего белка - кальмодуллина. Роль ПА заключается в создании рецепторной системы, через которую проникают ОФ и ЛФ. Кроме того, ПА способствует выработке в организме восприимчивого животного и человека специфических иммуноглобулинов, т.е. участвует в формировании антитоксического иммунитета. ЛФ проявляет цитотоксический эффект и вызывает отек легких.

Генетические детерминанты факторов патогенности сибиреязвенного микроба подробно изучены в результате клонирования генов отечного, протективного, летального компонентов токсина и капсулы, определения их нуклеотидных последовательностей, создания моделей возможных механизмов их регуляции. Наиболее распространенными подходами к генетическому типированию штаммов сибиреязвенного микроба являются определение плазмидного профиля штаммов, гибридизационный и ПЦР-анализ ДНК, которые в преимущественном большинстве случаев позволяют установить различия между полностью вирулентными штаммами, несущими гены факторов патогенности и штаммами со сниженной вирулентностью, частично или полностью утратившими детерминанты факторов патогенности.

Кроме возбудителя сибирской язвы, токсинобразующей способностью обладает B. сereus, который продуцирует растворимый диаррогенно-летальный токсин, вызывающий гибель мышей, крыс, грызунов, кроликов в течение 5-30 минут, у людей вызывает пищевую токсикоинфекцию, кератит, эндофтальмит, панофтальмит, эндокардит, менингит, остеомиелит и пневмонию.

Существует ряд отличительных признаков, позволяющих дифференцировать B. anthracis от близкородственных микроорганизмов: капсулообразование, лизис культуры под действием специфических сибиреязвенных бактериофагов, положительная проба с пенициллином (тест «жемчужное ожерелье»), специфическое свечение при исследовании люминесцентно-серологическим методом, отсутствие фосфатазной и лецитиназной активности, роста в условиях культивирования при температуре 45 ºС и др.

Дифференциальные признаки B. anthracis и B. сereus (типовой штамм 504 Т) приведены в таблице 19. Наличие 3 положительных тестов, в числе которых один из признаков патогенности, дает возможность отнести культуру к возбудителю сибирской язвы.

Таблица 19

Дифференциальные признаки B. anthracis и B. cereus

 

Вид возбуди- теля

Рост на бульоне

Подвижность

Наличие капсулы

Гемолиз

Протеолитическая активность (разжижение желатина)

Лецитиназная активность

Фосфатазная активность

Пенициллиназная активность

Феномен «жемчужного ожерелья»

Лизис сибиреязвенным фагом

Патогенность для животных (б/м и м/с)

Специфическое свечение при обработке ФА

B. anthracis

бульон прозрачен, осадок на дне (комок ваты)

-

+

±

±

±

±

-

+

+

+

+ (свечение на 3+ и 4+)

B. cereus

бульон мутный (разбивающийся крошковатый осадок)

+

-

+

+

+

+

+

-

-

±

-

Примечание: + - положительный признак

- - отрицательный признак

± - в редких случаях, в поздние сроки (3-4 сут выращивания)

 

ПРАКТИЧЕСКИЕ ЗАНЯТИЯ.

Занятие 1. Изучение биологических свойств B. anthracis и B. сereus

• Изучение характера роста культур на скошенном мясопептонном агаре.
• Изучение морфологии микробов в мазках, окрашенных по Граму.
• Посев 24-часовых агаровых культур в мясопептонный бульон, 0,3 % полужидкий агар, желатин, жидкую среду с желтком, на одну из капсулообразующих сред (скошенный молочно-солевой агар, среду ГКИ, скошенную среду Леффлера), на 2 чашки МПА, чашку МПА с желтком, чашку МПА с фенолфталеинфосфатом натрия и чашку 5 % кровяного агара.

Примечания:

- посевы в желатине оставить при комнатной температуре;

- посев на капсулообразующей среде поместить в СО₂-инкубатор и выращивать при 37 ºС в течение 24 ч;

- остальные посевы поместить при 37 ºС.

Занятие 2. Изучение биологических свойств B. anthracis и B. сereus

• Изучение суточного роста:

а) просмотр колоний на МПА, в том числе морфологии колоний под микроскопом;

б) изучение характера роста в МПБ.

• Изучение морфологии микроба в мазках, окрашенных по Граму, приготовленных с МПА и МПБ.
• Изучени подвижности в 0,3 % ПЖА.
• Изучение гемолитической активности на 5 % кровяном агаре.
• Изучение лецитиназной активности на:

а) жидкой среде с желтком,

б) на агаре с желтком.

• Изучение протеолитической активности и характера роста в желатине.
• Изучение фосфатазной активности на МПА с ФФФ.

Наличие или отсутствие фосфатазной активности определяют на питательной среде с фенолфталеинфосфатом натрия, на которую штрихами засевают суточную агаровую культуру для получения изолированных колоний. Через 18-20 ч инкубации при 37 ^оС на крышку чашки Петри вносят 1-2 мл 25 %-ного водного раствора аммиака. Чашку (крышкой вниз) выдерживают в течение 1 мин при 20±2^оС, после чего визуально проводят учет теста (крышку при этом заменяют). Большинство сибиреязвенных штаммов не способны вырабатывать фосфатазу и, следовательно, разлагать фенолфталеинфосфат натрия. Спорообразующие сапрофиты разлагают фенолфталеинфосфат натрия с образованием индикатора фенолфталеина. Выросшие на питательной среде колонии B. anthracis после добавления аммиака, имеющего щелочную реакцию, остаются бесцветными, а колонии спорообразующих сапрофитов окрашиваются в розовый или красный цвет.

· Изучение способности к капсулообразованию: из культур, выращенных на капсулообразующих средах в СО₂-инкубаторе, приготовление мазков и окрашивание по методу Гинса.

· Изучение чувствительности к пенициллину:

а) посев стандартной бактериологической петлей суточные бульонные культуры на чашки МПА, содержащие 10 и 50 ЕД/мл пенициллина в 1 мл среды;

б) постановка теста «жемчужное ожерелье» методом Груз (приложение);

в) постановка теста «жемчужное ожерелье» методом посева на чашки МПА с пенициллином. Контроль - агар без пенициллина.

• Изучение чувствительности к сибиреязвенному бактериофагу. При постановке пробы с фагом используют 3-6-часовую бульонную культуру, которую наносят пипеткой на пластинчатый МПА и в центр подсохшей капли петлей наносят бактериофаг. Учет через 6-24ч.

Примечания:

- работа начинается с посева культур в пробирку с МПБ и в пробирку МПБ с 0,5 ЕД/мл пенициллина для постановки теста «жемчужное ожерелье»:

- посевы в желатине оставляют при комнатной температуре.

Занятие 3. Изучение биологических свойств B. anthracis и B. сereus

• Регистрация чувствительности к сибиреязвенному бактериофагу.
• Регистрация чувствительности к пенициллину (рост на агаре с пенициллином в концентрации 10 и 50 ЕД/мл).
• Изучение протеолитической активности (характер роста в желатине).
• Изучение способности к спорообразованию:

а) приготовление мазков из 3-суточных агаровых культур;

б) окрашивание мазков по методу Пешкова или другим способом.

• Обеззараживание всех имеющихся в наличии культу;
• Заполнение журналов движения культур и учета ПБА, находящихся в рабочей коллекции
• Составление акта на уничтожение культуры возбудителя сибирской язвы.

Лабораторный диагноз

Современная лабораторная диагностика сибирской язвы включает бактериоскопический, бактериологический, биологический, аллергический и серологический методы.

Лабораторное исследование при сибирской язве проводят с целью выявления возбудителя, фрагментов ДНК или специфических антигенов от больного человека (содержимое везикул, карбункулов, отделяемое язв, струп, мокрота, кровь), из органов павших животных, кожевенного сырья, шерсти и объектов окружающей среды (почва, вода, смывы, сточные воды, воздух и т.д.).

Материал от больных людей, из объектов окружающей среды, сырье животного происхождения забирают в стерильные пробирки, банки или другую лабораторную посуду. Кровь для исследования берут из вены в пробирку, засевают в питательную среду и делают два тонких мазка на предметных стеклах. Материал следует отбирать так, чтобы полностью исключить возможность рассеивания заразного начала. С соблюдением строжайших мер предосторожности, согласно ветеринарной инструкции Министерства сельского хозяйства от 5 июня 1981 г. № 115/6 А «О мероприятиях против сибирской язвы», можно произвести отсечение уха у трупа животного с той стороны, на которой оно лежит, и направить его на исследование. Для этого ухо крепко перевязывают выше и ниже предполагаемой линии среза, место среза прижигают. Ухо заворачивают в пергаментную бумагу и полиэтиленовую пленку, упаковывают в металлическую коробку или ящик.

Сырье животного происхождения (шерсть, волосы, щетина) направляют для исследования в количестве не менее 30 г. Почву отбирают в количестве 50-70 г на пробу, воду на исследование направляют в объеме не менее 1 л. Отбор проб воздуха в количестве 50- 250 л производят с помощью приборов Кротова, Дьяконова, Речменского, Киктенко, каскадных импакторов.

Смывы с объектов окружающей среды рекомендуется брать тампоном, смоченным 0,9% раствором хлористого натрия, и помещать в стерильную посуду с плотно закрывающейся крышкой.

На объекты, подлежащие исследованию, составляют сопроводительный документ с указанием места, времени, даты забора и подписи взявшего материал. В лабораторию анализы направляют в пломбированных или опечатанных герметических деревянных или железных ящиках с нарочным.

Из исследуемого субстрата готовят несколько мазков. Окраску производят по Граму (на вегетативные клетки) и Пешкову (на споры). Бактериоскопию сочетают с люминесцентно-серологическим анализом. В мазках споры выявляются в виде овальных или круглых образований, окрашенных в голубой или синий цвет. В мазках от больного или трупа человека и животных возбудитель сибирской язвы определяется в виде характерных крупных палочек, окруженных капсулой (окрашивание по Гинсу). По результатам микроскопического исследования немедленно дают предварительный ответ.

Не загрязненный посторонней микрофлорой патологический материал от больного засевают на МПА и в пробирки с МПБ.

Загрязненный материал (кусочки органов трупа, мокроту, испражнения, кожу, шерсть, зерно, фураж, почву, мясные продукты, щетину) заливают 5-10-кратным количеством стерильной воды или 0,9 % раствором хлористого натрия. Полученную взвесь разливают в две пробирки. Одну пробирку с материалом прогревают на водяной бане при 65 ºС в течение 30 мин с целью уничтожения вегетативных форм.

Подготовленный для исследования материал (не прогретый и прогретый) засевают на чашки с МПА; МПА, содержащим 5 % дефибринированной крови барана; МПА, содержащим 0,01 % ФФФ. Посевы помещают в термостат при температуре 37 ºС.

Исследуемым материалом заражают биопробных животных (белых мышей и морских свинок) подкожно или внутрибрюшинно по 0,2-0,5 мл. Наблюдение за опытными животными длится до 10 дней, если они не пали. Павших животных вскрывают немедленно, производят посевы инфильтрата из места инъекции, крови и органов (сердце, селезенка, печень) на питательные среды, делают мазки, окрашивают их по Граму, одним из методов для выявления капсулы и антисоматической люминесцирующей сывороткой, отмечают патологоанатомические изменения. В положительном случае в мазках обнаруживают вегетативные клетки в виде коротких цепочек, отдельные микробные клетки, окруженные капсулой и специфически светящиеся клетки типичной морфологии при МФА. При вскрытии животных, павших от сибирской язвы, отмечают увеличенную селезенку, гиперемию внутренних органов, несвернувшуюся кровь. На месте введения материала наблюдаются различной величины студенистый геморрагический отек. Животных, выживших после 10-дневного срока наблюдения, исследуют в полном объеме.

После 20-часовой инкубации посевов исследуемого материала или органов биопробных животных отбирают колонии для дальнейшей идентификации. В первую очередь исследуют колонии, имеющие морфологию, характерную для возбудителя сибирской язвы. В случае отсутствия «подозрительных» колоний с каждого посева следует отбирать и изучать не менее 10 любых шероховатых колоний. Колонии отсевают на МПА и МПБ. Культуру идентифицируют по основным (проба со специфическим сибиреязвенным фагом, тест «жемчужного ожерелья», способность к капсулообразованию) и дополнительным (гемолитическая, фосфатазная и лецитиназная активность, специфическая флуоресценция) тестам.

У выделенной культуры B. anthracis определяют DcL для кроликов и DL₅₀ для морских свинок и белых мышей.

Для сокращения сроков бактериологического анализа предложен ускоренный биологический метод обнаружения возбудителя сибирской язвы. Согласно этому методу, исследуемый материал вводят внутрибрюшинно шести белым мышам по 0,5 мл. Через 1 и 2 ч вскрывают по паре мышей, из перитонеального экссудата и крови сердца делают мазки, из селезенки и печени - мазки-отпечатки. Мазки окрашивают одним из методов на обнаружение капсулы и капсульно-соматической люминесцирующей сибиреязвенной сывороткой. Параллельно производят посевы на питательные среды с целью выделения чистой культуры возбудителя. Оставшуюся пару мышей наблюдают до 10 суток.

Реакцию термопреципитации Асколи используют в случаях, когда трудно рассчитывать на выделение чистой культуры возбудителя: при исследовании шерсти, шкур, щетины, войлока, овчины, костной муки и прочих объектов, а также при начавшихся явлениях трупного разложения и т.д. Реакция основана на обнаружении термостабильных антигенов возбудителя, которые сохраняются гораздо дольше, чем жизнеспособные вегетативные клетки. Реакция Асколи позволяет быстро обнаружить сибиреязвенный антиген. Тем не менее, эту реакцию нельзя признать строго специфичной, поскольку полисахаридный антиген возбудителя сибирской язвы вступает в реакцию с преципитирующими сыворотками против близкородственных микроорганизмов (B. cereus, B. subtilis).

При люминесцентной микроскопии, проводимой с использованием антисоматической или антиспоровой люминесцирующих сывороток, возбудитель обнаруживается в вегетативной или споровой формах. При специфической реакции наблюдается яркое свечение периферии клеток (спор), имеющих характерную морфологию. Чувствительность метода высока и колеблется в пределах сотен тысяч микробных тел в одном миллилитре материала.

Для текущей и ретроспективной диагностики сибирской язвы у человека используют аллергическую пробу с антраксином. Последний вводят в дозе 0,1 мл внутрикожно на внутреннюю поверхность левого предплечья обследуемого. Результат учитывают через 24-48 ч. Положительная реакция проявляется с первых дней заболевания в виде гиперемии и инфильтрата на месте введения и оценивается в зависимости от размера этих элементов.

В последнее время в практику лабораторных исследований, в том числе при сибирской язве, широко внедряются современные методы генетики и молекулярной биологии. Для типирования штаммов B. anthracis можно использовать величину мол % ГЦ, гибридизационный анализ, различные методы так называемого фингерпринтинга ДНК и РНК, которые методически основываются на рестрикционном анализе, гибридизационных пробах и ПЦР.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ЗАНЯТИЯ