Обеззараживание исследуемого материала при постановке ПЦР

Использование ПЦР-анализа в практике лабораторной диагностики возбудителей I-II групп патогенности должно проводиться в строгом соответствии с СП 1.3.1285-03 и действующими нормативными документами.

Одно из основных противоэпидемических требований при постановке ПЦР – обеспечить надежную инактивацию исследуемого материала, зараженного или подозрительного на зараженность возбудителями инфекционных заболеваний. Однако применяемые в работе с возбудителями особо опасных инфекций табельные средства обеззараживания (растворы перекиси водорода, хлорамина, формалина и др.) не могут быть использованы в данном случае из-за их повреждающего действия на ДНК или ингибирования ПЦР.

В настоящее время разработаны способы обеззараживания исследуемого материала, зараженного или подозрительного на зараженность бактериями I-II групп патогенности, при проведении генодиагностических исследований методом ПЦР.

Согласно методическим указаниям (МУ 3.5.5.1034-01) отобранные для ПЦР пробы (суспензии органов, кровь, биологические жидкости, смывы с поверхностей, фильтраты почвы, взвеси бактериальных культур) инактивируют следующими способами:

1.Материал, зараженный или подозрительный на зараженность неспорообразующими бактериями I-II групп патогенности.

В пробу вносят проверенный на бактерицидное действие мертиолат натрия до концентрации 1:10 000 и прогревают при 56 °С в течение 30 минут. Затем 100 мкл обработанного метриолатом натрия материала переносят в микроцентрифужные пробирки типа эппендорф, добавляют 300 мкл лизирующего буфера с гуанидинтиоцианатом и прогревают при 65 °С 15 минут.

При исследовании на холеру используют метод прогревания образцов при 100 °С в течение 30 минут.

2.Материал, подозрительный на зараженность спорообразующими микроорганизмами II - IV групп патогенности, в том числе Bacillus anthracis.

Исследуемый материал обеззараживают, применяя метод герминации (прорастания) спор с последующей обработкой пенициллином и прогреванием, а затем воздействием лизирующего буфера с гуанидинтиоцианатом и прогреванием.

В пробирки с 0,9 мл бульона Хоттингера рН 7,2±1 засевают 0,1 мл исследуемого материала и инкубируют с аэрацией при 37 °С в течение 2,5 часов. Добавляют пенициллин (1000 ед/мл) и инкубируют при 37 °С 15 минут. После этого пробу прогревают на водяной бане 10 мин при 100 °С. Затем отбирают 100 мкл обработанной пробы в центрифужные пробирки типа эппендорф, добавляют 300 мкл лизирующего буфера с гуанидинтиоцианатом и прогревают при 65 °С в течение 15 минут.

После инактивации проб любым из вышеописанных методов дальнейшее исследование проводят как с обеззараженным материалом.

ОСОБЕННОСТИ ТЕХНИКИ БЕЗОПАСНОЙ РАБОТЫ С ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫМИ ЖИВОТНЫМИ

Требования к размещению и оснащению помещений блока инфицированных животных

В работе диагностических, научно-исследовательских и производственных лабораторий широко используют различных животных. Лабораторные животные служат для диагностики некоторых инфекционных заболеваний, моделирования инфекционных процессов, изучения вирулентности и токсигенности штаммов микроорганизмов, постановки биологической пробы с целью выделения возбудителя и др. Кроме того, они являются донорами, у которых берут кровь для получения сыворотки, плазмы, эритроцитов.

Для экспериментальной работы используют беспородных (конвенциальных) белых мышей, белых крыс, хомяков, морских свинок и кроликов. Однако в настоящее время выведено много линий мышей и крыс, которые отличаются цветом и специфическими реакциями организма при проведении научных экспериментов.

Крупные животные (овцы, лошади, ослы, обезьяны) также являются объектами исследований. В частности, на овцах проверяют эффективность вакцин против бруцеллеза и сибирской язвы, на обезьянах – против чумы, туляремии и других инфекционных заболеваний. Лошадей, крупный рогатый скот используют в качестве продуцентов различных иммунобиологических препаратов. Отдельные вопросы эпизоотологии, эпидемиологии и профилактики природно-очаговых инфекций изучают на отловленных в природе грызунах.

Многие виды исследовательской работы предполагают контакты персонала с лабораторными животными, которые могут быть как естественно, так и экспериментально инфицированы возбудителями болезней, представляющими опасность для людей. В связи с этим необходимо создать сотрудникам лабораторий безопасные условия труда. Соответствующее внимание необходимо уделять и экспериментальным животным.

В настоящее время разработан целый ряд нормативно-технических документов по размещению и проектированию вивариев, разведению и содержанию лабораторных животных.

Действующие санитарно-эпидемиологические правила (СП 1.3.1285-03) регламентируют требования к проведению исследований на лабораторных, диких позвоночных животных и членистоногих, их содержанию, а также обеззараживанию и последующей утилизации трупов отработанных животных и материалов.

Все манипуляции по приему, первичной обработке и вскрытию поступивших на исследование грызунов, заражению, вскрытию, содержанию биопробных животных и членистоногих, а также научно-исследовательскую работу с использованием экспериментальных животных проводят в специальных помещениях для инфицированных животных. Эти помещения должны быть отдельным самостоятельным или изолированным от основной лаборатории блоком. Планировка и набор помещений блока для инфицированных животных варьируют в зависимости от ПБА, с которым проводятся исследования, вида размещаемых животных и характера выполняемых работ (например, аэрозольный метод заражения требует особых условий).

Заразный блок обязательно должен включать комнаты: для одевания СИЗ, снятия СИЗ, приема и первичной обработки материала, зоолого-паразитологической работы, заражения и вскрытия животных, содержания биопробных животных (одна или несколько комнат), обеззараживания материала (автоклавная), мытья и хранения тары для биопробных животных, ведения записей.

Не разрешается в одной комнате одевать СИЗ и снимать их после работы с ПБА. Через комнату для одевания защитной одежды входят в блок для инфицированных животных, а через комнату для снятия одежды выходят.

Комнату для одевания защитной одежды оборудуют зеркалом, шкафами с необходимым запасом СИЗ, столом для регистрации времени и характера предполагаемой работы, заполнения этикеток на экспериментальных животных и полкой, на которую помещают металлические контейнеры с необходимыми для работы материалами (например, питательные среды, взвеси бактериальных культур, фиксатор для мазков-отпечатков и др.).

В комнате для снятия и обеззараживания защитных костюмов размещают емкости с дезрастворами для обеззараживания рук, обработки наружных поверхностей сапог (калош), замачивания халатов, капюшонов (косынок), полотенец, нарукавников, фартуков, резиновых перчаток; емкость с раствором соды (моющего средства) для погружения ватно-марлевых масок (для последующего кипячения) и банку с 70 º спиртом для погружения очков-консервов.

В этой комнате выделяют место (столик или полка) для контейнера, выносимого из заразного помещения. Наружную поверхность контейнера тщательно обрабатывают дезинфектантом перед выносом из вскрывочной.

После снятия, в установленном порядке (перед зеркалом), защитного костюма руки обрабатывают 70 º спиртом и моют с мылом под водопроводным краном.

Помещение для приема и первичной обработки заразного материала должно иметь собственный вход и сообщаться со вскрывочной (можно через «передаточное» окно). Комнату оборудуют столами для регистрации и размещения поступающего на исследование материала и холодильником.

В комнате для зоолого-паразитологической работы проводят определение вида, величины, возраста грызунов, их очес, сбор эктопаразитов, разборку гнезд грызунов и подготовку паразитологического материала к исследованию.

Помещение для заражения и вскрытия животных должно быть достаточно просторным и смежным с комнатой для содержания биопробных (зараженных) животных. Целесообразно, чтобы оно сообщалось через шлюзы с автоклавной, где проводят обеззараживание материала. В комнате размещают столы для вскрытия и заражения животных, настольный или напольный бокс биологической защиты для проведения конъюнктивального и интранозального заражения, шкаф для инструментов, холодильник для хранения трупов животных, небольшой столик для ведения протоколов опытов, электроприборы для кипячения инструментов и шприцов, емкости различных объемов с дезинфицирующими средствами.

Столы для заражения (рис. 10) и вскрытия животных (рис.11) должны иметь невысокие бортики и полку под столешницей на расстоянии 15-20 см от пола. Поверхности стола и полки покрывают водонепроницаемым материалом (лучше антикоррозионным металлом). На полке под столом размещают емкости с дезинфектантом для дуршлага (для стекания жидкости с трупа животного), корнцанга, которым захватывают трупы животных, и эмалированную миску, над которой их переносят на вскрывочную доску.

Рис.10. Рабочее место для заражения биопроб Рис.11. Рабочее место для вскрытия мелких лабораторных животных

 

Большая кастрюля с 3 % раствором моющего средства необходима для замачивания животных перед вскрытием с целью иммобилизации эктопаразитов, если они остались на животном после очеса и чтобы смочить волосяной покров животного.

Для обеззараживания лабораторной посуды используют бачки, ведра, кастрюли с дезинфицирующими средствами. Для трупов отработанных животных целесообразно иметь эмалированные ведра с ножной педалью для открывания крышки.

На стол для вскрытия животных ставят металлическую или эмалированную кювету с доской (50 см х 35 см) из мягких пород дерева. Доска должна быть без сучков и трещин.

Металлическая или эмалированная кювета (большой таз) понадобится также для заражения лабораторных животных. Над кюветой операторы набирают в шприц инокулюм, заражают животных и сбрасывают в неё мелкие отходы (тампоны, бумажную обертку со стерильных тампонов, спички и др.). Для заражения белых крыс и мышей в корень хвоста лучше иметь мелкосетчатые металлические каркасы с отверстием для хвоста.

Для содержания биопробных животных предусмотрены одна или несколько (если необходимо одновременно размещать животных, инфицированных разными ПБА) так называемых биопробных комнат. На стеллажах, которыми оборудованы эти помещения, размещают банки с зараженными животными. При работе с белыми крысами и дикими грызунами стеклянные банки с животными помещают в металлические сетчатые или перфорированные баки с фиксированной крышкой. Зараженных кроликов содержат в закрытых металлических ящиках, поставленных в металлические кюветы.

В сибиреязвенных лабораториях устанавливают металлические стеллажи, чтобы можно было их обрабатывать прожиганием (например, паяльной лампой).

Комнату для обеззараживания отработанного материала оборудуют автоклавом (лучше проходным), нагревательными приборами (газовые или электрические плиты, стерилизаторы и др.), шкафами, рабочим столом. Проходной автоклав устанавливают таким образом, чтобы его загрузка осуществлялась со стороны вскрывочной. Для проведения обеззараживания при помощи дезсредств следует иметь емкости различных размеров, которые при необходимости можно также размещать в любом помещении заразного блока: в комнате для снятия СИЗ, в биопробной, вскрывочной и там, где проводят зоолого-паразитологическую работу.

Помещение для мытья и хранения чистых банок, кроме прямого назначения, можно использовать для содержания до опыта чистых лабораторных животных и подготовки их к исследованию (измерение температуры, взвешивание, удаление шерсти), непродолжительного хранения кормов и подстилочного материала. Это помещение оборудуют ванной, стеллажами и шкафами.

Вскрытие животных

Поскольку целью биологического метода исследования является выделение патогена и его последующая идентификация, необходимо перед вскрытием животного подготовить специальные среды, определяемые видом возбудителя, предметные стекла для мазков-отпечатков органов, фиксатор, стерильные шприцы. Могут понадобиться пропитанные мертиолатом натрия (1:1000) фильтровальные бумажки для забора крови из сердца (для серологических исследований), стерильные деревянные палочки для посева органов при исследовании на бруцеллез и др.

Перед вскрытием оборудуют рабочее место. На вскрывочной доске размещают спиртовку на устойчивой подставке, два стакана с инструментами (хирургический пинцет, скальпель и ножницы в одном, анатомический пинцет и ножницы в другом), погруженными в 96 ^о спирт (1/3 объёма стакана), ступку или чашку Петри для приготовления суспензии органов, стеклянную воронку, штатив, на который можно положить предметные стекла. Понадобятся также пробирки с физиологическим раствором и стерильным песком для растирания в ступке органов вскрываемого животного, бактериологическая петля, пастеровские пипетки и простой карандаш. На столе с левой стороны кюветы расставляют питательные среды и стерильные чашки Петри, с правой – банку с нестерильными ватными тампонами и кристаллизатор с дезраствором для обработки рук (рис. 11).

Банки с биопробными животными, которых необходимо вскрыть, переносят из биопробной во вскрывочную комнату таким образом, чтобы не касаться внутренней поверхности горлышка. Выживших биопробных животных умерщвляют хлороформом (эфиром), которым смачивают ватный тампон и бросают в банку. Банку плотно накрывают крышкой или не пропускающим воздух материалом.

Все манипуляции с трупами животных проводят только инструментами, держа их за верхнюю часть. Перед вскрытием животное захватывают корнцангом и погружают в 3 % раствор моющего средства на 20-30 сек., после чего помещают на дуршлаг для освобождения от излишней жидкости и переносят на вскрывочную доску. После этого корнцанг погружают в дезинфектант. Перенос животного и корнцанга осуществляют только над дезраствором (рис. 12).

 

Рис.12. Подготовка животного к вскрытию Рис.13. Фиксация, вскрытие и посев органов биопробного животного

 

Животное помещают на вкрывочную доску и с помощью двух пинцетов растягивают за лапки, чтобы снять трупное окоченение. Хирургическим пинцетом, который держат в левой руке, захватывают левую верхнюю лапу животного и прикалывают ее в области пясти к доске. Такую же манипуляцию проделывают с правой задней лапкой, прикалывая ее к доске в области плюсны, и т.д. Приколышам придают наклонное положение, чтобы они не мешали в работе (рис.13).

После каждой манипуляции в ходе исследования экспериментатор должен обрабатывать руки дезраствором и насухо вытирать их полотенцем, чтобы исключить возможность падения инструментов с заразным материалом из мокрых рук.

Перед тем, как приступить к вскрытию, необходимо смочить в воде 3-4 ватных тампона, отжать и поместить их на вскрывочную доску. Одним тампоном обрабатывают шерсть животного и прикрывают отверстие мочеиспускательного канала, чтобы предотвратить возможное разбрызгивание содержимого мочевого пузыря во время вскрытия, другие тампоны используют для протирания инструментов перед обжиганием. Допустимо смачивать тампоны дезинфицирующим раствором, однако следует учитывать возможность снижения процента выделения возбудителя.

Вскрытие трупов следует проводить таким образом, чтобы исключить внесение микроорганизмов с поверхности в глубину тканей и перенос микробов из одного органа на другой. Поэтому следует тщательно обрабатывать инструменты после каждой манипуляции и обжигать – перед началом работы.

При вскрытии используют хирургический пинцет и ножницы, которыми одним движением рассекают кожу по средней линии брюшка от половых органов до нижней челюсти и делают разрезы в стороны к четырем лапкам. Осторожно отделяют кожные лоскуты скальпелем или сомкнутыми браншами ножниц (при вскрытии мелких грызунов), приподнимая кожу хирургическим пинцетом. При правильном вскрытии паховые и подмышечные лимфатические узлы остаются на кожных лоскутах, а подчелюстные и шейные – на мышцах шейной области. Использованные инструменты обрабатывают ватными тампонами, погружают в спирт и заменяют другим набором инструментов (рис.13).

После осмотра подкожной клетчатки и лимфатических узлов проводят посев кусочка измененного лимфатического узла (бубона) на среды методом отпечатков, захватив его анатомическим пинцетом. Затем делают отпечатки на двух предметных стеклах. При необходимости посеять материал в пробирки со скошенным агаром используют бактериологическую петлю, которую накаляют, прижигают к ней исследуемый материал и сеют методом отпечатков. После посева остаток органа снимают с петли пинцетом и только после этого прожигают петлю. Оставшийся на кожном лоскуте лимфоузел вырезают и переносят в ступку (чашку Петри) для биопробы.

Далее приступают к вскрытию брюшной и грудной полостей. Обжигают инструменты, захватывают хирургическим пинцетом брюшную стенку в области лобка, надрезают её и, введя не глубоко в брюшную полость закругленный конец ножниц, делают два дугообразных разреза вправо и влево к нижним ребрам. Затем надрезают нижние ребра, рассекают диафрагму по краю грудной клетки и продолжают разрезать с обеих сторон грудную клетку до верхних ребер. Образовавшийся лоскут из грудины и рёбер откидывают на мордочку животного. Инструменты очищают от следов крови с помощь тампонов и погружают в спирт.

После осмотра органов и оценки патологоанатомической картины приступают к посеву органов брюшной полости: печени, селезенки, парааортальных лимфатических узлов. С помощью анатомического пинцета и ножниц отсекают маленькие (≈ 5х5 мм) кусочки органов и, держа их пинцетом, сеют на чашки Петри и делают мазки-отпечатки. Часть материала (свежие кусочки) отбирают для приготовления суспензии органов. После каждой манипуляции инструменты тщательно очищают от следов крови, органов и погружают в спирт.

При исследовании животных на туляремию делают посев органов бактериологической петлей, на бруцеллез – стерильными деревянными палочками. В последнем случае кусочек органа помещают на конец палочки, осторожно вносят её в пробирку со скошенным агаром и растирают материал о внутреннюю стенку пробирки над поверхностью агара. Образовавшуюся массу тщательно втирают в поверхность среды. Использованную палочку погружают в дезраствор.

Кровь из сердца забирают пастеровской пипеткой, которую вводят в полость правого желудочка через предварительно «припеченное» накаленным скальпелем место. При этом сердце фиксируют анатомическим пинцетом.

У мелких грызунов отсекают верхушку сердца и, используя бактериологическую петлю, выступившие капли крови сеют на пластинчатый агар и в жидкие среды.

При необходимости забора крови для серологических исследований ею пропитывают фильтровальные бумажки с мертиолатом натрия. Пинцетом бумажки помещают в чашки Петри или в пробирки, если перед забором крови их свертывают в трубочку с помощью двух пинцетов.

Если животное загнившее, для посева берут костный мозг из трубчатой части бедренной кости. Кость предварительно освобождают от мышц, подкладывают под место предполагаемого разреза стерильный марлевый или ватный тампон и под прикрытием стеклянной воронки рассекают её. Придерживая пинцетом отрезок кости, бактериологической петлей или иглой забирают материал для посева.

У мелких грызунов исследуют головной мозг. На вскрывочную доску помещают слой ваты, смоченный дезраствором. Двумя пинцетами закрывают внутренние органы вскрытого животного кожными лоскутами и переворачивают труп спиной кверху на приготовленный ватный матрасик. Корень хвоста фиксируют приколышем. Отсепаровывают кожу головы за ушками, фиксируют её хирургическим пинцетом, введя острые концы в глазницы, и под прикрытием стеклянной воронки, которую держит помощник, рассекают кости черепа в области мозжечка. Не вынимая пинцет из глазниц, слегка приподнимают отсеченную часть черепа, чтобы обнажить мозг и бактериологической петлей берут материал на исследование.

В процессе посева, как уже упоминалось, делают мазки-отпечатки свежими кусочками органов на двух (или более) стеклах:

лимфатические узлы – четыре отпечатка

легкие – два

печень – один

селезенка – три

кровь – одна узкая полоса поперек стекла

Мазки-отпечатки не должны быть толстыми.

При вскрытии животного в протоколе отмечают состояние подкожной клетчатки и лимфатических узлов в паху, подмышечных впадинах. Учитывают их величину, форму и цвет. При осмотре органов грудной полости обращают внимание на наличие экссудата в полости плевры, гиперемию или ишемию (малокровие) легких. Регистрируют состояние органов брюшной полости, отмечая наличие очагов поражения (абсцессов).

После окончания вскрытия, осторожно извлекают приколыши, придерживая лапки животного пинцетом. Подносят к столу, как можно ближе, кастрюлю (бачок) с дезраствором для сбора отработанных трупов и, захватив двумя хирургическими пинцетами кожные лоскуты животного, опускают его в емкость. Туда же сбрасывают использованные тампоны. Тщательно обрабатывают вскрывочную доску смоченными в дезрастворе тампонами. Переносят в фиксатор предметные стекла с мазками-отпечатками. При всех манипуляциях используют пинцет. Чашки Петри, пробирки с посевами, штатив перед тем, как поместить в бикс для транспортировки, протирают смоченными в дезрастворе салфетками или ватными тампонами.

Для заражения биопробных животных используют суспензию органов вскрытого животного. Вначале органы под прикрытием воронки измельчают ножницами, если их собирали в чашку Петри, или растирают с помощью пестика и стерильного песка, если использовали ступку. В образовавшуюся массу постепенно добавляют физиологический раствор 1:4 – 1:5 и эмульгируют. Суспензию для заражения набирают в шприц через стерильный ватный тампон. Для посева суспензии на пластинчатый агар используют бактериологическую петлю. Можно прикоснуться к агару пестиком, которым растирали органы, а затем отпечаток рассеять петлей.