Встречный иммуноэлектрофорез (ВИЭФ)

Принцип. При встречном электрофорезе образование иммунных преципитатов в поддерживающей среде происходит в результате миграции АГ и АТ навстречу друг другу под действием электрического поля. Молекулы различных белков обладают различным зарядом и поэтому движутся при электрофорезе в щелочном буфере не только с разной скоростью, но и в разных направлениях - одни к аноду, другие к катоду.

Приготовление геля. Расплавляют 1 г агара или агарозы в 100 мл буфера на кипящей водяной бане. В качестве консерванта используют 2 мл 0,1% раствора мертиолата натрия. Горячий прозрачный раствор можно разлить на порции однократного потребления (по 20, 50 или 100 мл) и хранить при 4 °С в течение нескольких месяцев.

Техника проведения ВИЭФ. На подогретую обезжиренную стеклянную пластинку наносят несколько миллилитров раствора агарозы и осторожно проводят кромкой другой пластинки, наклоненной под углом 45 °. Струей горячего воздуха из фена гель высушивают в тонкую пленку. Затем на стекло, помещенное в кювету на горизонтальном столике с уровнем, выливают приготовленный гель из расчета 0,15-0,2 мл на 1 см² и дают ему застыть. С помощью пробойника и трафарета в геле вырезают лунки диаметром 2-5 мм, располагая их попарно на расстоянии друг от друга от 2-4 мм до 5-8 мм. Расстояние от краев пластинки должно быть не менее 1,5 см. Гелевые цилиндры удаляют с помощью водоструйного насоса. При использовании пластинок без агаровой пленки производят герметизацию донышка лунки, внося в них микрокаплю горячего агара (70-90 °С) и сразу его удаляя. В лунки с катодной стороны вносят по 0,01 мл АГ, а с анодной - такой же объем сыворотки (AT). Опыт обязательно сопровождают отрицательным (ФР или гетерологичный АГ) и положительным (АГ стандартный) контролями. Оба отделения камеры для электрофореза заполняют буфером. Пластины с гелем укладывают в соответствии с расположением полюсов и замыкают электрическую цепь полосками бумаги, смоченными буферным раствором. Включают охлаждение и ток и ведут ВИЭФ при напряжении 10 В/см² в течение 45 - 60 мин.

Учет и оценка результатов. Просмотр и изучение линий преципитации проводят в проходящем и падающем свете, а также при косом освещении на темном фоне с помощью лупы. От непреципитирующих белков гель отмывают путем погружения стекол 2-3 раза на 12 ч в ванночку с0,15 М раствором NaCl. Затем поверхность геля накрывают фильтровальной бумагой, смоченной в дистиллированной воде, и высушивают при комнатной температуре. Оценку осуществляют путем сравнительного изучения опытных и контрольных полос преципитации.

 

 

5.1.5. Методы иммунофлуоресценции

В 1950 г. Кунс и Каплан продемонстрировали возможность ковалентного связывания флуоресцентных красителей с АТ без утраты последними способности реагировать с АГ. В результате был разработан метод, сочетающий чувствительность и специфичность иммунологических реакций с топографической точностью микроскопии. Специальное оборудование позволяет визуально регистрировать свет, испускаемый ничтожным количеством флуорохрома. Флуоресцентные метки пригодны для методики двойного окрашивания, т.е. обработки образца двумя препаратами, различающимися по специфичности и метке АТ, которые окрашивают области локализации соответствующих АГ в разные цвета. Первая работа, включившая ИФ в арсенал лабораторных методов, была выполнена с применением конъюгатов, меченых флуоресцеином. Флуоресцеин и сейчас остается наиболее распространенным флуорохромом. Максимум светопоглощения конъюгатов, меченных флуоресцеином, регистрируется при 495 нм. Для них характерна интенсивная флуоресценция изумрудно-зеленого цвета, не свойственная аутофлуоресценции большинства тканей млекопитающих и с высокой чувствительностью воспринимаемая сетчаткой глаза. Для конъюгации с белками обычно применяют флуоресцеинизотиоцианат (ФИТЦ), изомер 1. Он легко присоединяется к белкам, образуя стабильные конъюгаты с заданным содержанием метки. Основной альтернативой флуоресцеину может служить родамин. Конъюгаты, меченные этим красителем, имеют максимум светопоглощения при 555 нм, а их оранжевая флуоресценция хорошо контрастирует с флуоресцеином. Поэтому родамин применяют главным образом в качестве второй метки при двойной иммунофлуоресценции. Флуорохром используют обычно в виде тетраметилродаминизотиоцианата. Еще один флуорохром с оранжево-красной флуоресценцией - это техасский красный. Максимум светопоглощения этого красителя (596 нм) в еще большей степени, чем у родамина, контрастирует с соответствующим значением флуоресцеина.

Флуоресцентные реагенты готовят из обладающих достаточной активностью и специфичностью препаратов АТ или АГ, которые конъюгируют с оптимальным количеством флуорохрома. Методически процедура конъюгации одноэтапна, предполагает инкубирование в течение определенного времени иммунного реагента с красителем и последующее промыванием полученного препарата от не связавшегося красителя. При наличии подходящих иммунных реагентов можно самостоятельно приготовить конъюгат, не уступающий по качеству коммерческим образцам. Свободный флуорохром может вызвать неспецифическое окрашивание и дает высокий уровень фоновой флуоресценции даже при незначительной (5 мкг/мл) концентрации свободного ФИТЦ. Кроме того, при длительном хранении конъюгаты могут диссоциировать на иммунный реагент и свободный краситель, что усиливает неспецифическое окрашивание. Это особенно свойственно конъюгатам с родаминовой меткой, этому во всех подозрительных случаях диагностикум проверяют на присутствие свободного красителя с помощью хроматографической методики (гель-фильтрация). Лучший метод удаления свободного красителя из препаратов конъюгата - гель-фильтрация на сефадексах G25 и G50. Пик меченого белка выходит в свободном объеме.

Мерой активности иммунофлуоресцентного препарата служит то максимальное его разведение, при котором еще сохраняется способность к специфическому окрашиванию. Это свойство важно не только с точки зрения экономии препарата, но и потому, что оптимальной эффективности окрашивания можно достигнуть лишь с высокими разведениями конъюгата, при которых соотношение между интенсивностью сигнала и фона достаточно велико. При невысоких разведениях конъюгата регистрируется сильная неспецифическая флуоресценция.

Различают прямую и непрямую иммунофлуоресценцию. В основе прямой иммунофлуоресценции лежит серологическая реакция между искомым АГ и видоспецифическим флуоресцирующим иммуноглобулином.

Образующийся в результате комплекс АГ - флуоресцирующее АТ приобретает способность светиться в УФ-лучах. С помощью МФА можно в течение 1-2 ч обнаружить наличие возбудителей инфекционных заболеваний в исследуемой пробе. Чувствительность метода 5۰10⁴ – 10⁵ м.к./мл. Непрямая иммунофлуоресценция основана на применении антиглобулиновых конъюгатов, которые позволяют обнаружить участки связывания предварительно нанесенных немеченых антител.

Преимуществом непрямого МФА является то, что при его использовании отпадает необходимость иметь большой набор различных специфических флуоресцирующих АТ. В качестве антиглобулиновых АТ обычно используют сыворотку козы или барана, иммунизированных сывороткой кролика, морской свинки, мыши и т.д. Непрямой МФА применяют не только для ускоренного обнаружения возбудителя (АГ), но и для обнаружения АТ в сыворотке больного.

Одна из наиболее важных особенностей МФА состоит в возможности одновременной идентификации двух разных АГ даже при их локализации в одной и той же области (двойная иммунофлуоресценция). В наиболее простом варианте для этого служит прямая иммунофлуоресценция с двумя различными по специфичности конъюгатами, один из которых содержит флуоресцеин, другой – родамин.

Оптимальные условия распознавания АГ в МФА определяются двумя факторами, зависящими от свойств конъюгата: интенсивностью специфической флуоресценции и ее контрастом с фоновым уровнем. Важно отметить, что нежелательная (фоновая) флуоресценция может быть связана, во-первых, с истинным неспецифическим окрашиванием, обусловленным электростатическими взаимодействиями, и, во-вторых, с нежелательным, но специфическимокрашиванием, обусловленным перекрестной реактивностью меченых АТ к другим тканевым АГ. Оба вида нежелательной флуоресценции нужно свести к минимуму без заметного снижения уровня специфической реакции. Это достигается путем одновременной окраски мазков флуоресцирующими конъюгатами в сочетании с контрастирующим сывороточным альбумином, обеспечивающим отличное по цвету свечение фона (посторонних примесей, клеточных элементов, гетерологичных микробов и т.п.). Перспективным для снижения неспецифической флуоресценции в препаратах является и метод окраски мазков Fab-фрагментами флуоресцирующих иммуноглобулинов без применения контрастирующих альбуминов.

Для индикации ПБАв иследуемых пробах в качестве основного следует применять прямой метод флуоресцирующих АТ. Непрямые модификации более трудоемки и требуют большей затраты времени. Их используют либо для выявления и титрования АТ в сыворотках крови людей и животных, либо для идентификации чистых культур возбудителей.

Прямой МФА для специфической индикации ПБА: для специфической индикации ПБА применяют прямой МФА в сочетании с контрастированием неспецифического свечения. С этой целью для окраски мазков используют смесь, состоящую из равных объемов специфических флуоресцирующих АТ, меченных флуоресцеин-5-изотиоцианатом (излучающим зеленый цвет), и контрастирующего альбумина нормальной сыворотки (лошадиной, бычьей, кроличьей), конъюгированного с родаминовым красителем (обладающим оранжевой люминесценцией). При окраске препаратов такой смесью специфический флуоресцирующий Ig сообщает зеленое свечение только гомологичному АГ, тогда как остальные компоненты препарата (тканевые элементы, гетерологичные микроорганизмы и их АГ, прочие примеси) приобретают способность светиться оранжево-красным цветом благодаря неспецифической физико-химической сорбции меченого альбумина.

Непрямой МФА (НМФА): в основе иммунофлуоресцентной серодиагностики (выявления и титрования специфических АТ в сыворотках крови) лежит применение непрямого метода флуоресцирующих антител как в модификации иммунофлуоресцентной окраски видовых сывороточных глобулинов, так и окраски комплемента морских свинок. При этом искомым в комплексе АГ + АТ + флуоресцирующий антисывороточный иммуноглобулин или АГ + АТ + комплемент + флуоресцирующий антикомплементарный глобулин являются АТ исследуемых сывороток людей или животных. Обработка мазков, содержащих заведомо известные микроорганизмы (диагностикумы), нисходящими разведениями исследуемых сывороток позволяет не только выявить специфические АТ, но и определить их титр.

При идентификации с помощью НМФА выделенных микроорганизмов используют наборы заведомо известных нефлуоресцирующих иммунных сывороток (иммуноглобулинов), которые берут для обработки мазков в различных (в зависимости от их активности) разведениях. Искомыми в этом случае оказываются АГ бактерий, риккетсий, хламидий или вирусов, содержащиеся в мазке и подлежащие идентификации.

Идентификация микроорганизмов с помощью НМФА. Для идентификации микроорганизмов с помощью НМФА необходимо располагать набором нефлуоресцирующих иммунных сывороток, специфичных в отношении различных бактерий, риккетсий или вирусов. Эти сыворотки используются на первом этапе обработки мазков, приготовленных из взвесей подлежащих идентификации микроорганизмов (клеточных культур, инфицированных вирусом). На втором этапе обработанные специфической сывороткой препараты докрашиваются антивидовым флуоресцирующим иммуноглобулином, гомологичным в отношении белков сыворотки, использованной на первом этапе (например, при обработке мазков на первом этапе специфической нефлуоресцирующей кроличьей сывороткой для второго этапа используют люминесцирующий иммуноглобулин к сывороточным глобулинам кролика). Техника люминесцентной микроскопии препаратов, окрашенных НМФА, аналогична применяемой при прямом варианте МФА.

Раньше неизбежное «выцветание» флуоресцентной метки при микроскопии было для МФА неотъемлемой и неразрешимой проблемой. Оно уменьшало популярность данного метода и способствовало более широкому применению других, нефлуоресцентных индикаторных систем для иммуноспецифического определения локализации антигенов. Позднее было описано применение парафенилендиамина, который значительно замедлял выцветание флуоресцентной метки, но был подвержен быстрому окислению на свету. Кроме того, он активно сенсибилизировал кожу. Более подходящий реагент - 1,4-диазобициклооктан (ДАБЦО). Он менее активно замедляет выцветание флуоресцентной метки, но более стабилен, дешев, не сенсибилизирует кожу, не диссоциирует на ионы и может храниться без дополнительной защиты.

Микроскопия. Для получения правильных результатов МФА необходимо до начала исследования тщательно сцентрировать всю осветительную систему микроскопа и подобрать опытным путем оптимальную комбинацию первичных и запирающих светофильтров. При использовании флуоресцирующих Ig, меченных ФИТЦ, чаще всего применяют возбуждающие светофильтры СС-4, СС-8 или СЗС-7 в комбинации с запирающим светофильтром типа ЖС-18. Просмотр мазков под микроскопом рекомендуется проводить в отраженных лучах, падающих на мазок через объектив. При иммунофлуоресцентном исследовании препаратов используют иммерсионные системы. При этом для выявления бактерий, риккетсий, грибов применяют масляную иммерсию (нефлуоресцирующее иммерсионное масло или диметилфталат). Для выявления вирусов в препаратах из клеточных культур или в мазках-отпечатках органов животных целесообразно использовать вводно-иммерсионные системы). Специальное нефлуоресцирующее масло (в случае его отсутствия – диметилфталат или трис-глицериновую смесь) наносят перед микроскопией на мазок. При использовании водно-иммерсионной системы на окрашенные препараты предварительно наносят трис-глицериновую смесь, затем препарат накрывают покровным стеклом, на которое сверху наносят каплю дистиллированной воды. При просмотре таких мазков объектив микроскопа погружают в каплю воды. При микроскопии окрашенных препаратов обычно используют окуляры 7^х или 5^х.

Для получения достоверных результатов исследования рекомендуется рассматривать под микроскопом не менее 20-25 полей зрения в каждом мазке (если морфологически типичные возбудители встречаются почти в каждом поле зрения, можно ограничиться просмотром меньшего числа полей зрения). В мазках, приготовленных из жидкой фазы пробы, особое внимание следует обращать на края капли (мазка), где чаще концентрируются клетки возбудителя.

Учет и оценка результатов.

При оценке результатов учитывают специфичность свечения и морфологию микроорганизмов. Специфически люминесцирующие микроорганизмы должны обладать характерной морфологией, иметь увеличенные размеры (по сравнению с их размерами в световом микроскопе) и более яркое свечение периферической части клетки. Неспецифическая флуоресценция характеризуется равномерным свечением всего тела клетки. Морфологические и структурные особенности микроорганизмов позволяют отчетливо дифференцировать их от бесструктурных люминесцирующих конгломератов, которые могут наблюдаться в препаратах.

Результаты МФА считаются положительными, если в мазке обнаруживаются хотя бы единичные (для мелких бактерий и риккетсий не менее 10 особей) морфологически типичные микроорганизмы либо пораженные вирусом (или риккетсиями) тканевые клетки (не менее 3-5 в препарате), специфически флуоресцирующие на 3-4 креста, при отрицательных контролях.

Контрольные исследования при постановке МФА. При исследовании любого неизвестного материала основным контролем специфичности являются все остальные мазки (препараты) данной пробы, которые оказались окрашенными гетерологичными по отношению к выявленному в пробе агенту флуоресцирующими иммуноглобулинами. Наряду с этим, МФА должен сопровождаться микроскопией препаратов, приготовленных из не содержащих микроорганизмы материалов (незараженные клеточные культуры, отпечатки органов здоровых животных) и окрашенных теми же специфическими люм. препаратами. Специфическая зеленая флуоресценция во всех контрольных мазках должна отсутствовать.

В заключение следует отметить, что методы, основанные на иммунофлуоресценции, не могут быть полностью стандартизованы. Многие детали методики, определяющие чувствительность, весьма вариабельны. Они включают, наряду с другими, свойства выбранного субстрата, активность реагентов, уровень фоновой флуоресценции, возможности микроскопа и квалификацию исследователя.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ЗАНЯТИЯ