Серологическая идентификация шигелл

Исследование антигенной структуры культуры начинают с ОРА на стекле со смесью № 1, в которую входят адсорбированные поливалентные сыворотки к S. flexneri 1-5, S. sonnei, S. flexneri 6. При положительной РА со смесью № 1 выделенную культуру агглютинируют отдельно каждой моносывороткой. Положительная реакция агглютинации с адсорбированной сывороткой к S. sonnei дает право дать ответ. Для установления серотипа и подсеротипа S. flexneri необходимо дополнительно поставить РА с серотипоспецифическими (к антигенам I, II, III, IV, V, VI), а затем с групповыми (3, 4, 6, 7, 8) сыворотками. При отсутствии агглютинации со смесью № 1 ставят реакцию агглютинации с другими адсорбированными поливалентными сыворотками, при этом учитывают отношение изучаемой культуры к манниту. Так, культуры, не расщепляющие маннит, исследуют с адсорбированными поливалентными сыворотками к S. dysenteriae; расщепляющие маннит – с адсорбированными поливалентными сыворотками к S. boydii. При наличии агглютинации выделенную культуру исследуют серотипоспецифическими сыворотками, обращая внимание на индолообразование. S. boydii сероваров 5, 7, 9, 11, 13, 15, 16, 17 и S. dysenteriae 2, 7, 8 сероваров способны образовать индол, у бактерий остальных серотипов это свойство отсутствует.

Таблица 10

Схема определения биоваров S. sonnei (по Солодовникову Ю.П. и др., 1971)

 

Биовар	Ферментация углеводов
Рамноза	Ксилоза	Мальтоза
I a	+ (1)	-	+ (1-2)
I b	+ (1)	-	+ (> 2)
II g	+ (>1)	-	+ (1-2)
II e	+ (>1)	-	+ (> 2)
III d	+ (1)	+ (1)	+ (1-2)
III c	+ (1)	+ (1)	+ (> 2)
IV f	+ (1)	+ (2 и позже)	+ (1 и позже)

Примечание: + ферментация (в скобках указанные сроки ферментации в днях);

- отсутствие ферментации

 

Лабораторная диагностика. Основным материалом для бактериологического исследования на дизентерию служат испражнения больного, которые засевают на дифференциально-диагностические среды (Плоскирева, Левина и др.) с последующим выделением чистой культуры и ее идентификацией на средах пестрого ряда и по антигенным свойствам для определения вида и серовара. Посевы просматривают через 18-20 ч после первичного высева. На средах Плоскирева и Эндо шигеллы формируют бесцветные (не ферментируют лактозу) прозрачные или полупрозрачные круглые выпуклые с ровным краем (S-формы) колонии диаметром 1-4 мм. Для S. sonnei характерно наличие колоний в R- форме (с зазубренным краем). При микроскопии выявляют грамотрицательные короткие палочки. Подозрительные колонии

пересевают в пробирки со средами Ресселя, Клиглера или Олькеницкого. С каждой чашки снимают не менее трех колоний.

При проведении массовых обследований лактозонегативные бесцветные колонии, выросшие на любой из используемых сред, исследуют в ориентировочной реакции агглютинации со смесью видовых дизентерийных сывороток.

На 3-й день учитывают изменения в комбинированных средах, проводят серологическую идентификацию. Отбирают культуры, не ферментирующие лактозу и мочевину, но разлагающие глюкозу, и засевают их на полужидкие среды Гисса с маннитом, мальтозой, лактозой, сахарозой, 1%-ную пептонную воду с индикаторными бумажками на индол и сероводород и в пробирку с 0,3%-ным питательным агаром для изучения подвижности. При необходимости проводят другие биохимические тесты. Ставят пробу с поливалентным дизентерийным бактериофагом и ориентировочную реакцию агглютинации с адсорбированными дизентерийными сыворотками. Если выделенная культура, обладающая биохимическими признаками шигелл, не реагирует с сыворотками, то ее следует прокипятить в течение 30 мин, т.к. многие шигеллы (особенно серогрупп А и С) обладают термолабильными антигенами, ингибирующими взаимодействие антител с О-антигенами. При необходимости определяют чувствительность выделенной культуры к антибиотикам.

На 4-й день исследования учитывают результаты посевов предыдущего дня.

Кроме проведения бактериологического анализа на дизентерию, для обнаружения антигенов возбудителя в крови, моче и испражнениях могут быть использованы следующие серологические реакции: РПГА, РСК, реакция коагглютинации, а также ИФА и ПЦР. Эти методы высокоэффективны, специфичны, пригодны для ранней диагностики.

Для серологической диагностики используют РПГА с соответствующими эритроцитарными диагностикумами, НМФА, реакцию Кумбса. Диагностическое значение имеет также аллергическая проба.

Сальмонеллезы

Род Salmonella получил название в честь американского микробиолога Сальмона (Salmon). Заболевания, вызываемые сальмонеллами, развиваются преимущественно в результате употребления инфицированных пищи и воды. Природный резервуар большинства возбудителей - человек и различные животные, в том числе пресмыкающиеся, земноводные, рыбы и птицы. Сальмонеллы вызывают брюшной тиф, паратифы, гастроэнтероколиты, септицемию. Бактерии некоторых видов являются возбудителями внутрибольничного сальмонеллеза.

В настоящее время род Salmonella включает два вида: S. salamae и S. choleraesuis, два одноименных подвида, из которых первый содержит около двух тысяч сероваров, а второй - четыре серовара: S. typhi, S. paratyphi A, S. gallinarum, S. pullorum.

Морфология и физиология. Сальмонеллы - мелкие грамотрицательные палочки, окруженные микрокапсулой, подвижны за счет перитрихиально расположенных жгутиков. Температурный оптимум для их роста - 35-37 ºС. Оптимум рН - 7,2-7,4. На питательных средах большинство сальмонелл образует мелкие (2-4 мм) прозрачные голубоватые S-формы колоний. На агаре Эндо они розоватые, прозрачные; на агаре Плоскирева - бесцветные и выглядят более плотными и мутноватыми; на висмут-сульфитном агаре - черные с металлическим блеском, окружены черным гало (S. paratyphi A, S. cho-leraesuis, S. abortusovis, S. gallinarum-pullorum образуют светлые зеленоватые колонии),среда под колониями также окрашена в черный цвет. Следует помнить, что компоненты висмут-сульфитного агара ингибируют рост возбудителя брюшного тифа. Сальмонеллы могут формировать также переходные и шероховатые тусклые и сухие R-колонии с неровными краями.

Сальмонеллы отличаются от E. coli меньшей ферментативной активностью. При ферментации глюкозы и ряда других углеводов образуют кислоту и газ (за исключением S. typhi и некоторых других серотипов), обладают лизин- и орнитиндекарбоксилазами, не имеют фенилаланиндезаминазы, растут на голодном агаре с цитратом (кроме S. typhi), не ферментируют лактозу (кроме S. arizonae, S. diarizonae), не образуют индола, не имеют уреазы, дают отрицательную реакцию Фогеса-Проскауэра.

Антигены. Сальмонеллы содержат О- (соматические), Н- (жгутиковые) и некоторые - К- (капсульный) антигены. Н-антигены могут существовать в двух разных фазах: специфической 1-й фазе и менее специфической, или групповой, 2-й фазе. Анализ антигенного строения является обязательным элементом микробиологической диагностики сальмонеллезов и проводится по схеме Ф. Кауфмана и П. Уайта, в основу которой положена общность О-антигена сальмонелл, объединенных в серологические группы: A, B, C, D, E, F и т.д. Всего известно около 65 серогрупп, в которых О-антигены обозначены цифрами. В сокращенном варианте эта схема представлена в таблице 11.

 

Таблица 11

Классификация сальмонелл по антигенной структуре

(в сокращенном варианте)

 

Серогруппа, вид или серовар	О-антиген	Н-антиген
фаза 1	фаза 2
Серогруппа А
S. paratyphi A	1,2,12	a	(1,5)
Серогруппа В
S. schottmuelleri	1,4, (5), 12	b	1,2
S. abony	1,4, (5), 12	b	e,n,x
S. typhimurium	1,4, (5), 12	i	1,2
S. derby	1,4, (5), 12	f,g	(1,2)
S. wien	1,4,12,27	b	1,w
S. haifa	1,4, (5), 12	z	1,2
S. heidelberg	1,4, (5), 12	r	1,2
Серогруппа С
S. hirschfeldii (S. paratyphi C)	6,7,(Vi)	c	1,5
S. choleraesuis	6,7	c	1,5
S. montevideo	6,7	m,s,(p)	-
S. leopoldville	6,7	b	1,5
S. bonn	6,7	1,v	-
Серогруппа D
S. typhi	9,12	d	-
S. enteritidis	1,9,12	g,m	(1,7)
S. dublin	1,9,12	g,p	-
S. rostock	1,9,12	g,p,u	-
S. moscow	9,12	b,g	-
S. gallinarum	1,9,12	s,q	-
Серогруппа E
S. london	3,10	l,v	1,6
S. anatum	3,10	e,h	1,6
S. amsterdam	3,10	g,m,s	-
S. zanzibar	3,10	k	1,5

 

К факторам вирулентности S. typhi относится Vi-антиген, представляющий собой капсульный полисахарид, защищающий микроб от фагоцитоза и комплемента. У подавляющего большинства других сальмонелл Vi-антиген отсутствует.

Определение сероварианта сальмонелл (серологическая идентификация) по схеме Кауфмана-Уайта

Выделенную культуру исследуют в ориентировочной реакции агглютинации на стекле с сальмонеллезной поливалентной сывороткой ABCDE. При положительном результате переходят к расшифровке сероварианта.

Определение антигенной структуры начинают с выявления О-антигена. На крышку от чашки Петри наносят пастеровскими пипетками капли сывороток, содержащих антитела против основных соматических антигенов 2, 4, 6, 9 групп А, В, С, D, соответственно. Если с одной из сывороток наступит агглютинация (например, 0-4), дальнейшее определение вида осуществляют сыворотками против жгутиковых антигенов (Н) в специфической фазе в пределах установленной группы (0-4 группы В). Для агглютинации О-сы-вороткой следует брать верхнюю часть выросшей культуры на скошенном агаре, а для агглютинации Н-сыворотками – из конденсата или из самой нижней части роста. После установления принадлежности культуры к тому или иному виду определяют полную структуру О-антигенов и Н-антигена и таким образом устанавливают антигенную формулу (серовар) выделенной культуры. При отсутствии реакции агглютинации с поливалентной адсорбированной О-сывороткой к сальмонеллам групп ABCDE культуру испытывают с поливалентной сывороткой, включающей антитела к антигенам сальмонелл редких групп.

Лабораторная диагностика. Основу лабораторной диагностики заболеваний, вызываемых сальмонеллами, выявления носительства, изучения обсемененности объектов окружающей среды, инфицированности пищевых продуктов составляет бактериологическое исследование материала по стандартной схеме.

При проведении лабораторной диагностики тифопаратифозных заболеваний учитывают патогенетические особенности этих инфекций, связанные с локализацией возбудителя в лимфоидной ткани внутренних органов, крови, желчи и выделением его с испражнениями и мочой. В первые дни заболевания выделяют гемокультуру путем посева крови в соотношении 1:10 в жидкие питательные среды, например, желчную среду Рапопорт. Накопительные среды с желчью являются элективными для возбудителей тифо-паратифозных заболеваний. Другие бактерии на них не растут или рост их замедлен. Желчь препятствует свертыванию крови, нейтрализует нормальные антитела сыворотки, разрушает комплемент и тем самым снижает бактерицидные свойства крови при сохранении ее питательных свойств, а также препятствует действию бактериофага. Результаты посевов крови на среде Рапопорт учитывают через 18-24 ч, изучают характер роста. При брюшном тифе среда Рапопорт окрашивается в красный цвет вследствие ферментации глюкозы, при паратифах А и В дополнительно выявляют газообразование. При отсутствии роста на среде Рапопорт посевы продолжают инкубировать и просматривают через 48, 72 ч, на 5-е и 10-е сутки. При наличии роста, после проверки на однородность выросшей культуры микроскопией окрашенного по Граму мазка, делают высев на дифференциально-диагностические среды. На 2-ой неделе заболевания выделяют копро- или уринокультуру после посева фекалий и мочи на обогатительные и дифференциально-диагностические среды. Выделенную культуру идентифицируют по биохимическим и антигенным свойствам. Из крови часто высевается брюшнотифозная культура, содержащая Vi-антиген, которая не агглютинируется О-сывороткой, т.к. Vi-антиген препятствует такой агглютинации. Если выделенный штамм не агглютинируется или агглютинируется не до диагностического (менее ½) титра, ставят реакцию агглютинации на стекле с Vi-сы-вороткой. Все культуры S. typhi фаготипируют с помощью набора Vi-фагов. Определяют чувствительность патогена к антибактериальным препаратам.

Для диагностики гастроэнтероколитов, возникающих в результате пищевых токсикоинфекций, для анализа отбирают испражнения, рвотные массы, промывные воды желудка, кровь, мочу, дуоденальное содержимое, секционный материал. Дополнительными объектами исследования являются остатки пищи, употреблявшейся заболевшими, исходные продукты и полуфабрикаты, корма животного и растительного происхождения, смывы с различного оборудования и предметов, предполагаемых в качестве фактора передачи возбудителя.

Окончательный диагноз пищевой токсикоинфекции устанавливают только после выделения возбудителя из организма больных людей и пищевых продуктов, его идентификации с установлением вида и серовара или биовара. Определение серовара проводят с помощью монорецепторных сывороток. Наиболее часто при токсикоинфекциях выявляют серовары S. typhimurium, S. enteritidis, S. anatum.

Возбудителем внутрибольничного сальмонеллеза чаще всего является S. typhimurium, которая может встречаться в виде трех биоваров, одинаковых по антигенной структуре, но различающихся по патогенности для белых мышей при энтеральном заражении и по чувствительности к антибиотикам. Однако нередки заболевания, вызываемые S. derby, S. heidelberg, S. wien, S. haifa и др., которые относятся к группе В. Эти сальмонеллы по своим морфологическим, физиологическим и антигенным признакам не отличаются от возбудителей пищевых токсикоинфекций.

Как правило, сальмонеллы, выделяемые при внутрибольничной инфекции, резистентны к 15-20 антибиотикам. Это связано с наличием у них конъюгативных R-плазмид, несущих множественную устойчивость к антибиотикам. Лабораторная диагностика внутрибольничных сальмонеллезов осуществляется по общепринятой схеме.

Серологические исследования. Серологическую диагностику брюшного тифа и паратифов, выявление и дифференциацию различных форм носительства проводят постановкой реакции агглютинации Видаля с О- и Н-диагностикумами. Основное диагностическое значение имеет реакция с О-диагностикумом, т.к. Н-антитела появляются позже О-антител и сохраняются после болезни или прививки более длительное время. Положительная реакция Видаля только с Н-диагностикумом указывает либо на ранее перенесенное заболевание (анамнестическая реакция) либо появляется в результате вакцинации (прививочная реакция). Диагностический титр с О-антигеном - 1:200. Большое значение для диагностики имеет нарастание титров в течение болезни.

Постановка реакции Видаля

Реакцию ставят с О-монодиагностикумом и Н-тифозными, Н-паратифа А и Н-паратифа В. На каждый диагностикум готовят ряд разведений испытуемой сыворотки. Контроль сыворотки – один для всех диагностикумов (таб.12).

Таблица 12

Постановка реакции Видаля

 

Ингредиенты (мл)	П р о б и р к и
				5 (КС)	6 (КА)
Физиологический раствор	-	1,0	1,0	1,0	-	1,0
Сыворотка больного (1:100)	1,0	Титровать по 1,0	1,0	-
Диагностикум ^х (капли)	1-2	1-2	1-2	1-2	-	1-2
Конечное разведение сыворотки	1:100	1:200	1:400	1:800	-	-

 

РНГА чувствительна и специфична с эритроцитарными О- и Vi-диагностикумами. Диагностическое значение имеет реакция с О-диагностикумом, т.к. антитела к Vi-антигену невысоки. Vi-антитела после полного выздоровления быстро исчезают, но при наличии брюшнотифозного носительства они присутствуют постоянно. В связи с этим РНГА с эритроцитарным Vi-диагно-стикумом применяется для выявления бактерионосительства.

Эффективным способом экспресс-диагностики сальмонеллезных и некоторых других болезней являются экспресс-тесты.. Определение патогенных микроорганизмов с помощью Singlepath-тестов производства фирмы Merck (Германия) основано на методе визуальной иммунохроматографии (разновидность иммуноферментного анализа).

Singlepath-тест Salmonella представляет собой диагностическую панель с лункой для добавления обогащенного образца, тестовой (Т) и контрольной (С) зонами. Антигены определяемых в образце бактерий взаимодействуют с меченными золотом антителами, включенными в состав теста, с образованием окрашенного комплекса антиген-антитело. Окрашенный комплекс связывается с иммобилизованными антителами с образованием линий в тестовом и контрольном окнах.

Схема выявления сальмонелл из образцов продуктов:

1. Неселективное обогащение на забуференной пептонной воде (25 г образца + 225мл BPW) при 37 °С в течение 18-24 ч.

2. Селективное обогащение на среде RVS - Rappaport-Vassiliadis (магниевая среда). 0,1 мл культуральной жидкости добавляют к 9,9 мл RVS среды. Инкубируют при 41 °С 18-24 ч.

3. Инактивация. 2 мл культуральной жидкости прогревают на водяной бане при 100 °С в течение 15 мин.

4. Singlepath-тест. В лунку диагностической панели вносят 160 мкл инактивированной культуральной жидкости. Результаты учитывают визуально в тестовой и контрольной зонах через 20 мин.

5. Подтверждение. Высев положительных результатов на дифференциально-диагностические среды РАМБАХ-агар, XLD-агар или висмут-сульфитный агар.

Преимущества метода:

• Экспрессность. Результат через 20 мин.

• Надежность. Высокая чувствительность и специфичность метода (99 %). Ясный и четкий положительный или отрицательный результат. Встроенный положительный контроль.

• Легко использовать. Нет необходимости в ходе исследо­вания добавлять какие-либо реагенты. Все компоненты включены в одну тест-пластинку. Отсутствуют сложные этапы в исследовании. Одноэтапный формат теста исключает возможные ошибки.

• Удобный. Необходимо добавить образец и учесть результат.

• Экономичный. Сокращает время исследования, снижает трудозатраты, уменьшает количество пересевов.

• Нет необходимости приобретать и обслуживать дорогостоящее оборудование.

Singlepath-тест одобрен Федеральным Центром Госсанэпиднадзора РФ (МР №24ФЦ/976) и разрешен к применению в лабораториях санитарно-эпидемиологической службы, осуществляющих государственный и ведомственный контроль, а также в производственных лабораториях.

 

ПРАКТИЧЕСКИЕ ЗАНЯТИЯ

Занятие 1.

Биологические свойства представителей родовых групп семейства энтеробактерий (Escherichia, Shigella, Salmonella, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter, Hafnia, Serratia, Morganella, Proteus, Yersinia, Edwardsiella)

• Изучение морфологии роста на скошенном агаре.
• Изучение морфологии микробов в мазках, окрашенных по Граму.
• Постановка пробы Gregersen с 3 % КОН.
• Посев полученной культуры на среду Клиглера, в среды минимального дифференцирующего ряда, на скошенный МПА, среды Эндо, Плоскирева, ЭМС, ВСА.

Примечания:

- при посеве на пластинчатые среды получить рост изолированных колоний;

- здесь и в дальнейшем посевы инкубировать 18-24 ч при 37 °С;

- посевы в среду Кларка и полужидкий агар дублировать и инкубировать при 37 и 22 °С.

Занятие 2.

Биологические свойства представителей родовых групп семейства энтеробактерий (Escherichia, Shigella, Salmonella, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter, Hafnia, Serratia, Morganella, Proteus, Yersinia, Edwardsiella)

· Изучение морфологии колоний на дифференциально-диагностических средах.

• Изучение морфологии роста культуры в бульоне.
• Подготовка мазков из бульонной и агаровой культур, окрашивание их по Граму.
• Учет результатов роста культуры на среде Клиглера и в средах минимального дифференцирующего ряда.
• При необходимости проведение предварительной серологической диагностики испытуемой культуры.
• Предварительное заключение о родовой принадлежности изучаемой культуры.

Примечание: при отрицательном результате реакции Фогеса-Проскауэра посевы на среде Кларка инкубировать еще 18-24 ч.

Занятие 3.

Биологические свойства представителей родовых групп семейства энтеробактерий (Escherichia, Shigella, Salmonella, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter, Hafnia, Serratia, Morganella, Proteus, Yersinia, Edwardsiella).

• Изучение морфологии 2-суточного роста культур на висмут-сульфитном агаре.

· Учет результатов роста в средах минимального дифференцирующего ряда через 48 ч.

· Постановка реакции с метиловым красным и Фогеса-Проскауэра.

· Заключение о родовой принадлежности изучаемой культуры.

Занятие 4.