Метод флуоресцирующих антител

Прямой МФА: взаимодействие специфических АГ и AT приводит к образованию комплекса АГ+АТ, выявляемого по флуоресцентной метке одного из компонентов в люминесцентном микроскопе.

Техника постановки реакции. На тщательно обезжиренное предметное стекло наносят каплю исследуемого материала и растирают бактериологической петлей для получения тонкого мазка. Из органов и тканей животных и секционного материала от людей делают, по возможности, тонкие мазки-отпечатки. Мазки подсушивают на воздухе и фиксируют 30 мин в этаноле, либо смеси Никифорова или охлажденном ацетоне. После фиксации препараты вновь подсушивают на воздухе.

Сухую люминесцирующую сыворотку растворяют в указанном на этикетке ампулы объеме дистиллированной воды. Непосредственно перед окраской препаратов люминесцирующую сыворотку разводят ЗФР до рабочего разведения (указано на этикетке ампулы), которое предварительно перепроверяют. Для этого микроскопируют мазки из эталонных культур микроорганизмов (диагностикумов), окрашенных люм. сывороткой, взятой в разных разведениях (обязательно на 1-2 разведения выше и ниже рабочего титра, указанного на этикетке). Максимальное разведение сыворотки, которое обеспечивает яркое (на 4+ и 3+) флуоресцентное окрашивание микробных клеток, называют ее красящим титром. В качестве рабочего разведения сыворотки, используемого для окрашивания исследуемых препаратов, применяют удвоенный красящий титр. Например, если красящий титр сыворотки оказался 1:32, то ее рабочее разведение будет 1:16.

На фиксированный мазок наносят 1-2 капли люминесцирующей сыворотки в рабочем разведении. Препарат помещают во влажную камеру (чашку Петри, кювету с крышкой с увлажненной фильтровальной бумагой, ватой) при 37 °С на 30 мин или при комнатной температуре на 30-40 мин. Затем препарат промывают в 3 сменах ЗФР в течение 5-10 мин с последующим ополаскиванием в дистиллированной или проточной водопроводной воде в течение 1-2 мин. Препараты высушивают на воздухе в вертикальном положении, не применяя фильтровальную бумагу.

Учет и оценка результатов. Учет результатов проводят визуально на основе выявления морфологических особенностей и локализации возбудителя, а также оценки интенсивности и специфичности (структуры) его свечения. Оценку интенсивности специфической флуоресценции объекта проводят с учетом ее структурных особенностей по следующей шкале: ++++ - яркая сверкающая флуоресценция изумрудно-зеленого цвета, четко выявляются морфологические особенности микроорганизма, вокруг корпускулярных агентов может наблюдаться ярко светящийся ободок; +++ - яркая флуоресценция зеленого цвета, морфологические особенности микроорганизма выявляются достаточно отчетливо, нередко хорошо видны периферические ободки; ++ - слабая флуоресценция желтовато-зеленого цвета, морфологические особенности микроорганизмов выявляются еще достаточно четко, периферические ободки почти не видны; + - очень слабая флуоресценция неопределенного цвета, микроорганизмы различаются с трудом; - -флуоресценция объекта отсутствует.

Положительным результатом считается люминесценция клеток на 4+ и 3+ при наличии не менее 3-5 специфически светящихся клеток в препарате.

Прямой МФА для специфической индикации ПБА:

Приготовление мазков. На тщательно обезжиренное предметное стекло наносят каплю исследуемого материала и растирают бактериологической петлей для получения тонкого мазка. Из органов и тканей делают тонкие мазки-отпечатки. Мазки подсушивают на воздухе и фиксируют в течение 30 мин. в 96 º этаноле, смеси Никифорова или охлажденном ацетоне. После фиксации препараты вновь подсушивают на воздухе (не обжигают) и подвергают окрашиванию. Для спорообразующих видов микроорганизмов фиксатором служит 96º этанол с 10 % формалина или с 3 % перекиси водорода.

Окраска препаратов флуоресцирующими Ig:на фиксированные и высушенные мазки наносят пипеткой рабочую смесь специфического флуоресцирующего иммуноглобулина и контрастирующего альбумина так, чтобы вся площадь мазка была покрыта конъюгатом. Обработку мазков проводят во влажной камере при 37 ºС в течение 30 мин. Затем конъюгат смывают ЗФР, мазки дважды промывают по 10 мин ЗФР, после чего ополаскивают дистиллированной водой и высушивают при комнатной температуре.

До начала работы флуоресцирующие иммуноглобулины и контрастирующий альбумин растворяют дистиллированной водой в объеме, указанном на этикетке ампулы. К использованию пригодны лишь те конъюгаты, которые легко и без осадка растворяются в течение 1-2 мин. Растворенные препараты могут затем храниться при 2-4 ºС в течение 2-3 недель, будучи плотно закрытыми. Окраску мазков производят так называемой рабочей смесью конъюгатов, которую готовят также заблаговременно, но срок ее хранения при 2-4 º С не должен превышать семи дней.

Важнейшим условием правильного составления рабочей смеси конъюгатов является оптимальный подбор в ней соотношения флуоресцирующего Ig, меченного ФИТЦ, и альбумина, меченого родамином. Эти соотношения для каждой новой партии флуоресцирующих конъюгатов подбирают опытным путем, поскольку указанные на этикетке ампулы рабочие разведения являются ориентировочными. Титрование флуоресцирующих конъюгатов целесообразно проводить на контрольных мазках, содержащих гомологичные флуоресцирующим иммуноглобулинам микроорганизмы или их АГ.

Определение красящего титра контрастирующего альбумина. Из цельного раствора альбумина, меченного родамином, готовят ряд двукратных разведений в стерильном ЗФР рН 7,2 от 1:2 до 1:128, наносят на контрольные «грязные» мазки (с посторонней микрофлорой) и инкубируют во влажной камере при 37 ºС в течение 30 мин. Затем мазки промывают дважды по 10 мин ЗФР, ополаскивают дист. водой, подсушивают на воздухе и микроскопируют. В полевых условиях вместо ЗФР мазки можно промывать проточной водой, а затем ополаскивать дистиллированной водой. Последнее разведение контрастирующего альбумина, дающее оранжево-красное свечение микробных клеток в мазке на 1-2 креста, принимают за красящий титр. Соответственно рабочее разведение меченого альбумина будет в 2 раза выше красящего титра (табл. 4).

Таблица 4

Пример титрования флуоресцирующего альбумина

Препараты	Интенсивность свечения клеток в мазках при разведении альбумина	Красящий титр	Рабочее разведение
	1:4	1:8	1:16	1:32	1:64	1:128
Мазок-отпечаток с тампона (смыв)	+ + +	+ + +	+ + +	+ + +	++	-	1:64	1:32
Мазок-отпечаток селезенки мыши	+ + +	+ + +	+ + +	+ +	-	-	1:32	1:16
Перевиваемые клетки амниона человека	+ + +	++ +	+ + +	+ +	+	-	1:64	1:32

Условные обозначения:

+++ - отчетливо выраженное оранжево-красное или красно-бурое свечение

+ + - красное свечение различных оттенков

+ - серо-желтое (бурое) свечение

- - свечение отсутствует или видна аутолюминесценция

 

Определение красящего титра специфических флуоресцирующих Ig в смеси с контрастирующим альбумином, меченым родамином. Двукратные разведения испытуемого конъюгата специфических флуоресцирующих Ig смешивают с двойным рабочим разведением контрастирующего альбумина и окрашивают контрольные мазки, приготовленные из взвеси гомологичных микроорганизмов, как сказано выше. Последнее разведение, обеспечивающее яркое зеленое изумрудное специфическое свечение микробов на 3-4+ на оранжево-красном фоне препарата, является красящим титром испытуемого специфического Ig. Для дальнейшей работы смешивают в равных объемах удвоенные рабочие разведения альбумина и специфического флуоресцирующего Ig (табл. 5).

Таблица 5

Пример титрования флуоресцирующего иммуноглобулина в присутствии альбумина

Препараты	Характер флуоресценции	Интенсивность свечения при различных разведениях специфического конъюгата в смеси с альбумином, взятым в рабочем разведении 1:16	Красящий титр флуоресцирующего иммуноглобулина	Рабочее разведение иммуноглобулина в смеси с альбумином
		1:4	1:8	1:16	1:32	1:64
Мазок из смыва	Специфическая зеленая	+ +	++++		+ + +	+	1:32	1:16
	Неспецифическая красная	+	+ +	+ +	+ +	+ +
Мазок-отпечаток селезенки мыши	Специфическая зеленая	+ + + +	++++	++++	+++	+ +	1:32	1:16
	Неспецифическая красная	+	+ +	+ +	+ +	+ +
Монослой перевиваемых клеток амниона человека	Специфическая зеленая	++++	++++	++++	+++	+	1:32	1:16
	Неспецифическая красная	-	+	+ +	+ +	+ +

 

Примечание: Красящий титр флуоресцирующего иммуноглобулина в этом примере равен 1:32. Однако для окраски мазков специфический конъюгат, как и контрастирующий альбумин, используется в рабочем разведении, которое должно быть в два раза концентрированнее его красящего титра. Следовательно, рабочая смесь конъюгатов, выбранная на основании приведенных в данном примере результатов, должна состоять из разведенного 1:16 специфического флуоресцирующего иммуноглобулина и контрастирующего альбумина, взятого в разведении 1:16. Чтобы получить в рабочей смеси эти оптимальные соотношения, оба конъюгата должны быть сначала разведены 1:8, а затем смешаны в равных объемах.

Непрямой МФА. Подготовка мазков для проведения серологических анализов. Мазки с заведомо известными микроорганизмами (бактериями, риккетсиями) готовят либо из стандартных корпускулярных АГ и диагностикумов (например, из корпускулярных антигенов для реакции агглютинации), либо из взвесей 1-2-суточных культур живых аттенуированных вакцин (EV, СТИ, туляремийной, бруцеллезной и др.). Для выявления противовирусных АТ используют пластинки с монослоем культуры клеток, инфицированных соответствующим вирусом. Взвеси из корпускулярных АГ или живых культур вакцинных штаммов бактерий готовят на ФР концентрацией примерно 500 млн м.к./мл (по оптическому стандарту мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича). Взвеси, приготовленные из сухих корпускулярных АГ, целесообразно предварительно выдержать в течение 2 - 4 ч при температуре 4 – 10 °С для более полной регидратации и только потом использовать их для приготовления мазков. Это снижает в ряде случаев неспецифическую сорбцию на АГ сывороточных протеинов и позволяет избежать ошибок при интерпретации результатов анализа. Мазки готовят на специальных графленых предметных стеклах со шлифованной поверхностью на одном конце (для маркировки стекла). Микробную взвесь (АГ) наносят на стекло тонкой пастеровской пипеткой (по 6-8 капель на каждом стекле). Затем мазки высушивают на воздухе при комнатной температуре и фиксируют в течение 15 мин на холоде ацетоном или 96 ° этиловым спиртом. Мазки из микробной взвеси или корпускулярного АГ можно готовить впрок. При условии их хранения при температуре не выше 0 °С они могут быть пригодны для использования в течение месяца. Монослои инфицированных вирусом клеточных культур, длительному хранению не подлежат и должны быть использованы в течение ближайших 2-3 дней.

Подготовка исследуемых сывороток: исследуемые с помощью НМФА сыворотки людей и животных какой-либо предварительной специальной обработке не подвергаются. Их инактивацию проводят путем прогревания при 56 °С в течение 30 мин. Для определения титра специфических АТ испытуемые сыворотки разводят ФР в пределах от 1:10 до 1:1280 и более (в случае необходимости). Используемые контрольные сыворотки (заведомо нормальная или гетерологичная содержащимся в мазке антигенам) берут в разведении 1:20 - 1:40.

Подготовка антивидовых флуоресцирющих. иммуноглобулинов. При выявлении АТ в сыворотках крови с помощью НМФА используют (в зависимости от применяемой модификации метода) либо антивидовые флуоресцирующие иммуноглобулины, гомологичные белкам исследуемой сыворотки, либо флуоресцирующие иммуноглобулины к комплементу морской свинки. Сухие конъюгаты растворяют дистиллированной водой в объеме, указанном на этикетке ампулы (обычно в 0,5 мл). К использованию годны лишь те конъюгаты, которые легко и без осадка растворяются в течение 1 -2 мин. Для обработки мазков готовят рабочие смеси, состоящие из равных объемов флуоресцирующего антивидового (антикомплементарного) иммуноглобулина и контрастирующего альбумина, взятых в рабочих разведениях. Поскольку указанные на этикетках ампул рабочие разведения флуоресцирующих конъюгатов являются ориентировочными, рекомендуется предварительно (для каждой новой серии препаратов) определить их красящий титр и рабочее разведение. Методика титрования конъюгатов и выбора оптимальных соотношений при составлении рабочей смеси аналогична используемой при подготовке препаратов для прямого варианта МФА.

При титровании антивидового (антикомплементарного) флуоресцирующего иммуноглобулина на первом этапе обработки мазков используют заведомо положительную (гомологичную содержащемуся в мазке АГ) нефлуоресцирующую сыворотку в разведении 1:5-1:10.

Техника титрования исследуемых сывороток. Исследование сывороток с помощью НМФА включает в себя два этапа обработки мазков, содержащих заведомо известные микроорганизмы (АГ). На первом этапе, в зависимости от избранной модификации метода, на мазки наносят последовательные двукратные разведения испытуемых сывороток (иммунофлюоресцентная окраска сывороточных иммуноглобулинов) или смеси равных объемов комплемента морской свинки, взятого в разведении 1:10 (сухой комплемент) или 1:20 (свежий, жидкий комплемент), и последовательных двукратных разведений испытуемой сыворотки (иммунофлуоресцентная окраска комплемента). При нанесении и распределении по мазку соответствующих разведений сыворотки (или их смесей с комплементом) не следует допускать их слияния и перемешивания. Мазки с нанесенными на них разведениями сыворотки инкубируют 20 мин во влажной камере при температуре 37 °С, затем в течение нескольких секунд промывают под легкой струей воды, отмывают в двух сменах (по 10 мин каждая) ЗФР и ополаскивают дистиллированной водой. После отмывки препараты высушивают на воздухе при комнатной температуре. На втором этапе окраски на высохшие мазки наносят по капле рабочей смеси соответствующего антивидового (антикомплементарного) флуоресцирующего иммуноглобулина и контрастирующего альбумина. Мазки вновь выдерживают 20 мин во влажной камере при температуре 37 °С. После этого с мазков стряхивают остатки смеси конъюгатов, отмывают в двух сменах (по 10 мин каждая) буферного раствора и споласкивают дистиллированной водой. В полевых условиях вместо ЗФР мазки можно промывать 10 мин проточной водой, а затем ополаскивать дистиллированной водой. Окрашенные мазки высушивают на воздухе при комнатной температуре.

Учет и оценка результатов микроскопии. О наличии специфических антител в исследуемых сыворотках (серодиагностика) судят по степени яркости свечения микроорганизмов в окрашенных препаратах. За титр сыворотки принимают то наибольшее ее разведение, которое еще обеспечивает свечение гомологичных микроорганизмов интенсивностью не менее чем на 2 креста при отрицательных результатах в контроле. При оценке диагностического значения положительных результатов анализа обращают внимание не только на высоту титра обнаруженных АТ, но и на динамику их нарастания при исследовании парных сывороток. Повышение титра АТ в сыворотках, взятых повторно через 7-10 дней, указывает на инфекционный процесс. Отсутствие динамики может свидетельствовать об анамнестическом характере выявленных АТ. При идентификации с помощью НМФА выделенных микроорганизмов о видовой (групповой) принадлежности последних судят по результатам титрования заведомо известных диагностических сывороток. Гомологичные микроорганизмы реагируют со специфическими сыворотками в максимальном разведении, близком к их титру.

Контрольные исследования. Контрольные исследования при иммунофлуоресцентной серодиагностике предусматривают: 1. исследование препаратов, обработанных на первом этапе заведомо «отрицательной» сывороткой и докрашенных соответстветствующим ей антивидовым флуоресцирующим иммуноглобулином; 2. исследование препаратов, обработанных непосредственно (без первого этапа) смесью флуоресцирующего антивидового иммуноглобулина с контрастирующим альбумином. В обоих случаях специфическая флуоресценция должна отсутствовать.

При иммунофлуоресцентной идентификации выделенных микроорганизмов препараты обрабатывают на первом этапе серией нефлуоресцирующих специфических сывороток, а затем докрашивают соответствующими рабочими смесями конъюгатов. Специфическое свечение при этом может наблюдаться лишь в одном из окрашенных препаратов, а именно в обработанном на первом этапе гомологичной изучаемому агенту сывороткой. Все остальные препараты являются контрольными. Специфическая флуоресценция в них должна отсутствовать

Варианты иммуносорбентного анализа на твердой фазе

Твердофазные методы исследования предполагают использование твердой фазы в качестве основы для сорбции на ней иммунных реагентов: АТ (АГ). Все этапы реакции протекают на границе 2-х фаз: твердой и жидкой. Не прореагировавшие компоненты удаляются с помощью отмывания. Чувствительность этих методов превышает аналогичный показатель агглютинационных реакций.

Иммуноэритроадсорбционный метод (ИЭАМ). Принцип иммуноэритроадсорбционного метода обнаружения АГ (АТ) состоит в том, что специфические АТ (АГ), адсорбированные на стенках U-образной лунки твердой фазы, специфически взаимодействуют с искомым АГ (АТ), а последний затем иммунологически связывается со специфическими АТ (АГ), мечеными эритроцитами. Меченые эритроцитами АТ (АГ), вступившие во взаимодействие с АГ (АТ), остаются на стенках иммуносорбента (с образованием регистрируемого визуально "зонтика"), при отсутствии АГ (АТ) в исследуемом материале эритроциты под действием силы тяжести скатываются на дно лунки, формируя "пуговку". В качестве твердой фазы в ИЭАМ используют 60-луночные микрокамеры с объемом лунок 20 мкл – камеры Терасаки. Используемые в ИЭАМ эритроцитарные конъюгаты могут также применяться в РПГА в качестве антительного (антигенного) диагностикума.

Радиоиммунный анализ (РИА) – метод, в котором в качестве маркера АТ (АГ) используются радионуклиды – ¹²⁵I, ¹⁴C, ³H, ⁵¹Cr и т.д. После взаимодействия АГ с АТ отделяют образовавшийся радиоактивный иммунный комплекс и определяют его радиоактивность в соответствующем счетчике (бета- или гамма-излучение): при этом интенсивность излучения прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул АГ или АТ.

Иммуноферментный анализ (ИФА) (ELISA) – (от англ. ezyme-linked immunosorbent assay) - метод, в котором в качестве маркеров АТ (АГ) используют ферменты. Благодаря простоте и высокой чувствительности твердофазные иммуноферментные системы удобны для выявления АГ, АТ и иммунных комплексов. Проблемы специфичности ИФА по характеру и сложности те же, что и у других иммунологических методов. Они могут быть сведены к минимуму путем постоянного контроля качества реагентов и стандартизации методических приемов. Применение в ИФА моноклональных антител, обладающих строго определенной специфичностью и одинаковой аффинностью, позволяет повысить качество исследований (специфичность).

Твердофазными носителями для проведения ИФА могут быть различные материалы. В ранних разработках, как правило, использовали пластмассовые пробирки, на смену которым быстро пришли панели для титрования с лунками, имеющими плоское прозрачное дно, и удобные для измерения оптической плотности продуктов реакции на специальных приборах-ИФА-ридерах (от англ. to read -читать). Последние модификации в качестве твердой фазы предусматривают использование палочек и шариков, а также нитроцеллюлозных мембран, активно сорбирующих белки. Модификация с использованием мембран получила название «дот»-ИФА. Планшетный вариант ИФА на протяжении еще многих лет останется наиболее распространенным для решения большинства научных и прикладных задач.

Основные принципы твердофазного ИФА: Возможность проведения иммуноферментного анализа независимо от его модификации основана на следующих четырех принципах: 1. Различные ферменты, наибольшее распространение из которых получили пероксидаза хрена (ПХ) и щелочная фосфатаза (ЩФ), можно ковалентно присоединить к АГ или АТ различными химическими методами в таких условиях, когда оба компонента конъюгата сохраняют свою биологическую активность (способность взаимодействовать с субстратом и антигенсвязывающую активность). 2. Большинство АГ, в том числе белки, пептиды, полисахариды и бактериальные липополисахариды самопроизвольно сорбируются на поверхности пластика. АТ, будучи белками, тоже сорбируются на пластике и при этом сохраняют антигенсвязывающую активность. Именно на этом принципе основан первый этап реакции, заключающийся в «сенсибилизации» панелей АГ или АТ. Адсорбированные на твердой фазе АГ и АТ уже не смываются буфером, содержащим детергент, тогда как не связавшиеся реагенты легко удаляются отмыванием. 3. В «сенсибилизированных» лунках инкубируют исследуемый образец и стандартные реагенты. При этом на поверхности твердой фазы формируются иммунные комплексы, состоящие из одного или нескольких слоев. Не связавшиеся компоненты на каждом этапе удаляют отмыванием, что позволяет добиться высокой специфичности анализа в реакции входящего в состав конъюгата фермента с индикаторным субстратом. 4. При связывании конъюгата АТ=фермент или АГ=фермент с иммобилизованным иммунным комплексом активный центр фермента остается доступным для взаимодействия с субстратом. Инкубация субстрата в лунках с иммобилизованным конъюгатом приводит, как правило, к развитию цветной реакции. Эту реакцию останавливают на нужной стадии, а выраженность окрашивания оценивают визуально, сравнивая со стандартами, или инструментально по оптической плотности. Некоторые варианты метода, например, «дот»-ИФА и «метод индикаторной полоски» предполагают окрашивание самой твердой фазы. В этих случаях используют хромогенные субстраты, дающие продукты в виде нерастворимых, иммобилизованных на твердой фазе окрашенных преципитатов (табл.6).

Таблица 6

Ферменты и субстраты к ним

Фермент	Коньюгирующий реагент	Растворимый субстрат	Рекомендуемая длина волны при фотометрии	Нерастворимый субстрат
пероксидаза хрена (ПХ)	1. глутаральдегид (двухэтапный метод) 2. Мета -периодат натрия 3. N- сукцинимидил – 3 (2- пиридилдитно) пропинат (СПДП)	Орто- фенилендиаминдигидрохлорид (ОФД) Тетраметилбензидин 2,2`-Азино-ди (3-этил) бензотиазолинсульфоновая кислота (АБТС) 5-Аминосалициловая кислота (АСК)	650 (и 405 после установки реакции)	диаминобензидин 4-Хлоро-1-нафтол 3-Амино-4-этилкарбазол (АЭК)
Щелочная фосфатаза (ЩФ)	Глутаральдегид (одноэтапный метод)	N- n -нитрофенилфосфат щелочной (ПНФФ)	402-412	Нафтол As-mx фосфат + диазоль синий 2С (НАФДС) Нафтол As-mx фосфат + диазоль красный ТР (НАФДК) 5-бромо-4-хлоро-3-водил-фосфат (БХНФ)
β- галактозидаза (β-Г)	Мета- малеимидобензол – N- гидроксисукцинимидный эфир (МБГС)	Орто- нитрофенил- β-D галактозид (ОНФГ)
Уреаза	Глутаральдегид (одноэтапный метод)	Бромкрезоловый пурпурный (БП)
Пенициллиназа	Глутаральдегид (одноэтапный метод)	Иод и крахмал	Визуальный учет обесцвечивания синей окраски

 

Методические варианты ИФА для определения антител и антигенов

Для выявления и количественного определения АТ и АГ используют различные модификации ИФА с сенсибилизацией твердой фазысоответствующим иммунным реагентом.

«Сэндвич»-вариант ИФА для определения АГ и иммунных комплексов

Благодаря методической простоте, специфичности и высокой чувствительности широкое распространение получил так называемый «сандвич» -вариант ИФА. Его несложно модифицировать в «дот» - ИФА. В соответствии со схемой данного варианта анализа АТ (лучше моноклональные или высокоаффинные), адсорбированные на твердой фазе, инкубируют с исследуемым образцом (а также с положительным и отрицательным контрольными образцами и разведениями стандартного АГ). После отмывания в лунки вносят меченные ферментом АТ к тому же АГ и далее раствор субстрата к используемому в конъюгате ферменту. Через определенное время развившуюся цветную реакцию останавливают ингибитором фермента.

Непрямой ИФА для выявления АТ

Этот вариант ИФА наиболее удобен для повседневного анализа образцов сывороток на наличие специфических АТ. Для проведения анализа в лунках панелей адсорбируют АГ (экстракт из бактерий, паразитов или вирусов), далее в них инкубируют образцы сывороток или другого материала (например, молока, слюны, спинномозговой жидкости). Специфические АТ, связавшиеся с сенсибилизированными АГ, выявляют с помощью антиглобулиновых антител либо стафилококкового белка А, меченых ферментом. Стафилококковый белок А=Ф является универсальным конъюгатом, с помощью которого можно исследовать на наличие специфических АТ сыворотки крови людей и любых видов животных (кроликов, мышей, баранов, лошадей и т.д.). Визуализация реакции происходит при добавлении в лунки соответствующего ферменту раствора субстрата.

Для постановки ИФА важное значение имеют следующие моменты:

1. Панели для ИФА и их способность адсорбировать АТ или АГ. Полистироловые и полихлорвиниловые панели, выпускаемые различными производителями, могут сильно различаться по способности адсорбировать иммунные реагенты. Серьезные различия возможны и между отдельными партиями панелей одной марки. Лучше всего использовать высококачественные панели, предназначенные специально для ИФА. В этом случае «краевые» эффекты и различия в адсорбционной способности между отдельными планшетами и партиями сведены к минимуму, а оптические свойства лунок обеспечивают высокую точность учета результатов.

2. Оптимальная концентрация АТ или АГ для сенсибилизации панелей. Подбор оптимальной концентрации АТ или АГ для сенсибилизации панелей - один из наиболее ответственных этапов в ИФА. От него во многом зависят результаты проведения анализа. Сенсибилизация панелей недостаточным количеством АТ или АГ снижает чувствительность анализа и создает условия для неспецифической адгезии конъюгата непосредственно на пластике, неэкранированном сенситином. Это приводит, в конечном счете, к повышению фонового уровня реакции и неверной оценке результатов. Сенсибилизация чрезмерным количеством АТ или АГ может привести к неспецифическому связыванию реагентов с иммобилизованным сенситином.

3. Неспецифическое связывание и свойства конъюгата. Для высокочувствительного ИФA необходимо использование конъюгатов с возможно более высоким соотношением между уровнем сигнала (положительный результат) и шума (фоновый уровень). Высокое неспецифическое связывание может быть вызвано большими размерами полимеров конъюгатов. Для этого целесообразно использовать не концентрированные растворы конъюгатов, а разведенные до рабочего титра. Кроме того, неспецифическое связывание удается уменьшить, блокируя ответственные за этот процесс участки твердой фазы слабым раствором инертного белка в буфере для сенсибилизации. С этой целью обычно рекомендуют бычий сывороточный альбумин (БСА). После сенсибилизации твердой фазы соответствующими иммунными реагентами раствор БСА инкубируют в лунках панелей (30-45мин) при комнатной температуре. Панели затем отмывают и проводят последующие этапы анализа.

4. Свойства субстрата. Ортофенилендиамин (ОФД), применяемый в качестве субстрата для ПХ, светочувствителен и на свету в смеси с перекисью водорода (H₂O₂) спонтанно окрашивается в желтый цвет. Поэтому субстрат готовят непосредственно перед постановкой реакции в сосуде, полностью обернутом фольгой. Панели после внесения раствора субстрата инкубируют в темноте. Реакцию следует остановить в тот момент, когда оптическая плотность (ОП) положительного контроля достигнет оптимального уровня при отсутствии окрашивания в отрицательных образцах. Для обеспечения стандартности результатов необходимо точно знать время оптимального развития цветной реакции и температуру ее проведения.

5. Хранение сенсибилизированных панелей. Панели, сенсибилизированные АТ и некоторыми АГ, после отмывания и тщательного высушивания можно хранить в герметичной упаковке с вложенным влагопоглотителем (гранулами силикагеля) при температуре 4 ˚С. Устойчивость разных АГ к высушиванию и хранению после иммобилизации на пластике неодинакова.

Интерпретация результатов ИФА

При визуальной оценке. Интенсивность окрашивания в лунках с отрицательными контролями должна быть низкой. Ее оценивают как отрицательную (-) или неопределенную (±). В тех лунках, где прошла положительная реакция, степень окрашивания оценивают по четырехбальной шкале: от 4+ до 1+. Образцы, при титре которых получены неясные пограничные результаты, необходимо исследовать вновь в меньших разведениях, проводя повторно отрицательные контроли.

При спектрофотометрической оценке. Оценка результатов по пороговому уровню реакции. В простейшем случае результат считают положительным, если ОП исследуемого образца превышает максимальную ОП в лунках с отрицательными контролями.

Варианты твердофазного иммуноферментного анализа

Известно несколько методических вариантов ИФA, различающихся по типу твердой фазы.

ИФA на стрипах

ИФA обычно проводят в планшетах для микротитрования. Помимо целых панелей выпускаются и отдельные полоски (стрипы) с одним рядом лунок, из которых затем можно собрать панель необходимого размера и добиться таким образом экономии расходных материалов. Результаты анализа в таких сборных панелях учитывают визуально или на обычном ИФА-ридере.

ИФА со стержнями

Эта модификация заключается в том, что в каждую лунку панели погружают стержень, сенсибилизированный АГ или АТ. Таким образом, иммунные комплексы формируются на стержнях, а окрашивание растворимого субстрата обычно происходит в лунках. Результаты реакции учитывают так же, как и при традиционном ИФА в панелях. Вместо растворимого субстрата при осуществлении данного варианта ИФА можно использовать нерастворимый - в этом случае окрашивание регистрируют на «стержнях». Такой вариант, однако, менее удобен для точного количественного учета.

ИФА в кюветах

Кюветы имеют больший объем по сравнению с лунками панелей и, следовательно, большую адсорбционную емкость, а также оптически прозрачные боковые стенки для измерения ОП на специальном ридере с горизонтальным направлением луча, что позволяют достичь более высокой чувствительности анализа. Однако данный вариант ИФА более дорогой, так как из-за больших объемов кювет происходит значительный расход реагентов. ИФА в кюветах применяют главным образом для проведения одноэтапного гомогенного анализа низкомолекулярных веществ.