Пцр, направленная на выявление днк Brucella spp.

ГенБрутест-система предназначена для выявления Brucella spp. в клиническом материале, органах животных и объектах внешней среды.

Для детекции Brucella spp. подобрана система, состоящая из двух пар праймеров.Праймеры Bru31 и Вгu32 обеспечивают специфическую амплификацию фрагмента ДНК размером 299 п.н., праймеры ВгuЗ и Вru4 - специфическую амплификацию фрагмента ДНК размером 175 п.н. Тест-система выявляет в ПЦР 1х10³ м.к./мл Brucella spp.

В состав тест-системы входят следующие компоненты:

1-2. Праймеры Bru31 и Вru32 - водные растворы двух олигонуклеотидных праймеров, синте­зированных в автоматическом ген-синтезаторе ДНК.

3-4. Праймеры ВгuЗ и Bru4 - водные растворы двух олигонуклеотидных праймеров, синтези­рованных в автоматическом ген-синтезаторе ДНК.

5. Taq-полимераза - термостабильная ДНК-полимераза в буферном растворе, рекомбинантная.

6. дНТФ - водный раствор дезоксирибонуклеозидтрифосфатов.

7. ДНК (положительный контроль) - водный раствор ДНК В. abortus 19 ВА.

8. 10хБ - 10-кратный буферный раствор.

9. MgCl₂ - 1% раствор магния хлорида.

10. Н₂0 - вода бидистиллированная.

11. Масло - масло вазелиновое стерильное.

Объектом для исследования может быть клинический материал, объекты внешней среды, органы животных, а также микробные взвеси при идентификации выделенных культур. При работе с клиническим материалом и загрязненными объектами внешней среды необходим предварительный этап подготовки проб (выделение ДНК). Подготовку проб осуществляют с помощью поставляемого отдельно набора и прилагаемой к нему инструкции.

Подготовка проб из клинического материала и объектов внешней среды

При анализе крови к образцу объемом 1 мл после забора добавляют 1/10 объема 4% раствора цитрата натрия и осторожно перемешивают.

Молоко в количестве 10 мл центрифугируют при 8 000 g в течение 10 мин. Надосадочную жидкость удаляют. Осадок суспендируют в 1 мл 0,9 % раствора хлорида натрия

Смывы с поверхностей берут с помощью стерильного ватного тампона во флакон с 50 мл 0,9 % раствора хлорида натрия.

Кусочки органов в количестве 1 г растирают в ступке с 0,5-1,0 г стеклянного порошка, добавляют 1-2 мл 0,9 %.раствора хлорида натрия. Надосадочную жидкость отбирают через ватный тампон в отдельные пробирки.

Почву в количестве 10 г тщательно перемешивают с 50 мл 0,9 % раствора хлорида натрия, отстаивают в течение 10 мин для оседания крупных частиц. Надосадочную жидкость центрифугируют при 8 000 g в течение 10 мин. Осадок ресуспендируют в 1 мл 0,9 % раствора хлорида натрия.

Обеззараживаниепроводят прогреванием проб, в которые добавлен мертиолят натрия до конечной концентрации 0,01%, при температуре 56⁰ С в течение 30 мин.

Выделение ДНКиз объектов внешней среды осуществляют с помощью набора для выделения ДНК в соответствии с прилагаемой к нему инструкцией. Выделенную ДНК в объеме 10 мкл используют в ПЦР.

Для исследования чистых культур микроорганизмов готовят бактериальную взвесь клеток, выросших на плотной питательной среде, в 2 мл 0,9 %.раствора хлорида натрия по стандартному образцу мутности 10 единиц ФГБУ ГИСК им. Л.А. Тарасевича Роспотребнадзора (ОСО 42-28-8511), что эквивалентно 1,0х10⁹ м.к. возбудителя бруцеллеза в 1 мл. Затем взвесь разводят 0,9% раствором хлорида натрия до концентра­ции 1x10 м.к./мл и обеззараживают добавлением мертиолята натрия до конечной концентра­ции 1:10000 (0,01%) и прогреванием при 56 ^СС в течение 30 мин. После этого 1 мл обеззара­женной взвеси переносят в микропробирку типа «Эппендорф» объемом 1,5 мл и центрифуги­руют при 8000 g в течение 15 мин. Осадок ресуспендируют в 50 мкл стерильной бидистиллированной воды, прогревают на кипящей водяной бане в течение 10 мин и центрифугируют при 8000 g в течение 1-2 мин. Супернатант в объеме 10 мкл используют для ПЦР.

Реактивы для проведения ПЦР извлекают из холодильника и полностью разморажи­вают при комнатной температуре. Для проведения амплификации ДНК готовят микропроби­рки объемом 0,6 мл в соответствии с количеством образцов. Все реакционные компоненты добавляют отдельными наконечниками с помощью дозаторов переменного объёма: 0,5-10, 5-40 и 40-200 мкл. В отдельной микропробирке объемом 0,6 мл готовят смесь компонентов из расчета на одну пробу в следующей последовательности: Н₂0 - 6,8 мкл; 10хБ - 2,5 мкл; дНТФ - 2,5 мкл; MgCl₂ - 1 мкл, праймер ВгuЗ1 - 1 мкл, праймер Вru32 - 1 мкл; Taq - полимеразы - 0,2 мкл.

Смесь перемешивают пипетированием и вносят по 15 мкл в заранее маркированные микропробирки. Затем наслаивают по 30 мкл масла и вносят: 10 мкл бидистиллированной воды (в отрицательный контроль), 10 мкл ДНК (положительный контроль), а в остальные - по 10 мкл проб.

Общий (конечный) объём во всех пробирках должен составлять 25 мкл. Микропробирки помещают в амплификатор и проводят полимеразную цепную реак­цию по следующей матричной схеме: предварительная денатурация ДНК при (94±0,1)°С в течение 3 мин. Затем проводят 25 циклов. Каждый цикл амплификации включает в себя: денатурацию ДНК при температуре (94±0,1)°С в течение 40 сек, отжиг праймеров при тем­пературе (60±0,1) °С в течение 40 сек, синтез комплементарной цепи при температуре (72±0,1) °С в течение 40 сек. После последнего цикла пробы прогревают в течение 3 мин при температуре (72±0,1) °С. При необходимости оставить пробы после реакции на ночь, их по­мещают в холодильник при температуре (4±0,1) °С или вводят дополнительный цикл на амплификаторе (4±0,1) °С 12 ч и более.

После первого этапа амплификации для повышения чувствительности и специфично­сти реакции проводят вторую стадию. Для этого готовят реакционную смесь из расчета на одну пробу: Н₂0 - 15,8 мкл, 10хБ - 2,5 мкл, дНТФ - 2,5 мкл, MgCl₂, праймеров Вгu3 и Bru4 -по 1 мкл каждого и фермента Taq-полимеразы - 0,2 мкл. При постановке второго этапа ПЦР реакционную смесь разливают по 24 мкл в каждую пробирку, наслаивают на нее по капле ва­зелинового масла и вносят под масло по 1 мкл амплификата, полученного после первого этапа реакции.

Термоциклирование проводят по следующей схеме: 25 циклов включающих в себя де­натурацию при 94 °С - 30 сек, отжиг праймеров при 60 °С - 30 сек и синтез при 72 °С - 30 сек. Заключительный цикл 72 °С - 3 минуты.

К продуктам амплификации (после второго этапа), находящимся в микропробирках после термоциклирования, с помощью микропипетки добавляют по 4 мкл буферного раствора для нанесения проб, перемешивают пипетированием и по 15 мкл переносят в лунки геля. Затем закрывают крышку аппарата, подсоединяют блок питания, включают его и проводят электро­форез. Электрофорез проводят в соответствии с инструкцией по эксплуатации прибора в те­чение 30 - 40 мин. при градиенте напряжения 10 В/см до прохождения лидирующего красителя 2/3 длины трека.

Оценка результатов:

По окончании электрофореза агарозный гель извлекают из камеры и помещают на 10 мин в ванночку с раствором бромистого этидия в концентрации 0,5 мкг/мл для окрашивания ПЦР-продуктов. Результат проведения ПЦР регистрируют и документируют в проходящем ультра­фиолете с использованием документирующей видеосистемы или зеркального фотоаппарата с пленкой типа "Микрат" 300. Результаты оценивают по наличию фрагментов ДНК, полосы которых располагаются на том же уровне в геле, что и полосы в положительном контроле с препаратом ДНК. Фраг­мент ДНК Brucella spp. после второго этапа ПЦР имеет размер 175 н.п.

Отрицательный контроль: полоса на уровне положительного контроля должна отсут­ствовать; наличие полосы свидетельствует о контаминации компонентов тест-системы.

Наличие полос, располагающихся выше или ниже контрольной, является неспеци­фичным ответом и во внимание не принимается.

Список использованной литературы:

1. Адамов А.К., Наумшина М.С. Холерные вибрионы /Саратов: изд-во ун-та, 1984. – 328 с.

2. Антракс (вопросы иммунологии, клиники и лаборатор­ной диагностики) / под ред. Э.Н. Шляхова. – Кишинев: Изд-во «Картя Молдовеняскэ», 1964. – 164 с.

3. Апарин Г.П., Голубинский Е.П. Микробиология чумы (руководство) // Иркутск, Изд-во иркут. ун-та, 1989. - 92 с.

4. Атлас по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии // Под ред. А.А. Воробьева, А.С. Быкова - М.: МИА, 2003. – 233 с.

5. Балахонов С.В. Использование полимеразной цепной реакции в лабораторной диагностике инфекционных заболе­ваний // Журн. инфекционной патол. – Т. 3, № 2. – Иркутск, 1996. – С. 8–11.

6. Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности): Санитарно-эпидемиологические правила: СП 1.3.1285-03//Бюллетень нормативных и методических документов Госсанэпиднадзора - Москва, 2003, - Вып.3 (13).– С. 67-132.

7. Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней: Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3.2322-08 и дополнения к ним СП 1.3.2518-09. – М., 2009.

8. Белозеров Е.С.Бруцеллез. Медицина, 1985 г.— 183 с.

9. Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология / Л.Б. Борисов. – М.: Медицинское информационное агентство, 2002. – 734 с.

10. Бруцеллез / Под ред. П. А. Вершиловой — М., 1972 г.— 439 с.

11. Бургасов П.Н., Рожков Г.И. Сибиреязвенная инфекция. – М.: Медицина, 1984. – 212 с.

12. Галактионов В.Г. Иммунология: Учебник. – М.: «РИЦ МДК», 2005.

13. ГОСТ 12.4, 064-84 «Костюмы изолирующие. Общие технические требования и методы испытания».

14. Дроздов С.Г., Гарин Н.С., Джиндоян Л.С., Тарасенко В.М. Основы техники безопасности в микробиологических и вирусологических лабораториях. – М.: Изд-во Медицина, 1987. – 256 с.

15. Забор, транспортировка, хранение клинического мате­риала для ПЦР-диагностики: метод. рекомендации. – М.: ООО Интерлабсервис, 2005. – 16 с.

16. Иммунология. Методы исследования // Под ред. И. Лефковитса, Б. Перниса. - Москва, Мир, 1983. – 339 с.

17. Иванова С.М. Возбудитель сибирской язвы // Возбудители зоонозных инфекций. Частная медицинская микробиоло­гия с техникой микробиологических исследований / под ред. А.С. Лабинской, Л.П. Блинковой, А.С. Ещиной. – М.: Медицина, 2005. – С. 211–223.

18. Иммунология в 3-х томах // под ред. У. Пола. – Москва Мир, 1987.

19. Инструкция и методические указания по лабораторной, клинической диагностике, профилактике и лечению сибирской язвы у людей. – М.: Минздрав СССР, Главное управление ка­рантинных инфекций, 1980. – 63 с.

20. Использование ультрафиолетового бактерицидного излучения для обеззараживания воздуха в помещениях. Руководство. – М.: Федеральный центр госсанэпиднадзора Минздрава России, 2005. – 46 с.

21. Кирдей Е.Г. Иммунология. Иркутск, 2000. – Изд. ИГМУ. – 231 с.

22. Кетти Д. Антитела. Методы. – М.: Мир, 1991.- 300 с.

23. Коллинз Ц.П. Новые методы иммуноанализа. – М.: Мир, 1991. – 485 с.

24. Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза, легионеллеза: Методические указания: МУ 3.3.2.2124-06. - М., 2007. - 35 с.

25. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. – Санкт-Петербург: Специальная литература, 2002.-591с.

26. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней. Практическое руководство под ред. академика РАМН, профессора Г.Г. Онищенко, чл.-корр. РАМН, профессора В.В. Кутырева // М.: Медицина, 2009. - 472 с.

27. Лабораторная диагностика холеры: МУК 4.2.2218-07.

28. Лимфоциты. Методы // Под ред. Дж. Клауса. – Москва, Мир, 1990. -395 с.

29. Медицинская микробиология / Главные редакторы В.И. Покровский, О.К. Поздеев. – М.: ГЭОТАР Медицина, 1998. – 1183 с.

30. Медицинская микробиология / Под ред. А.М. Королюка, В.Б. Сбойчакова. – СПб., 1999. – 267 с.

31. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология / Под ред. А.И. Коротяева. – СПб.: «Специальная литература». – 1998. – 580 с.

32. Методические рекомендации по детекции детерминант вирулентности холерного вибриона с использованием мультиплексной ПЦР /Балахонов С.В., Миронова Л.В., Погорелов В.И., Урбанович Л.Я. – Иркутск, 2002. – 11 с.

33. Методические указания МУ 3.1.2007-05. 3.1. Профилактика инфекционных болезней. Эпидемиологический надзор за туляремией. – М., 2005. – 34 с.

34. Методические указания по профилактике и лабораторной диагностике бруцеллеза людей. Москва, 1980 г. - 54 с.

35. Методические указания по микробиологической диагностике заболеваний, вызванных энтеробактериями / М.: МЗ СССР, 1984. – 36 с.

36. Методические указания по применению бактерицидных ламп для обеззараживания воздуха и поверхностей в помещениях МУ 11-16 / 03-06 от 28.02.95. – М.: Минздрав-Медпром России, 1995.

37. Методы выделения и идентификации энтерогеморрагической кишечной палочки E. coli O157:H7: Методические указания. МУК 4.2.992-00 / Минздрав России – М., 2001. – 29 с.

38. Механизмы и диапазон изменчивости холерных вибрионов / Под ред. В.Н. Милютина. – Ростов-на-Дону, 1981. – 175 с.

39. Микробиологическая диагностика сибирской язвы / Л.И. Маринин [и др.]. – М.: ВУНМЦ МЗ РФ, 1999. – 222 с.

40. Никитин В.М. Справочник методов иммунологии // Кишенев, «Штиинца», 1982. -303 с.

41. Обеззараживание исследуемого материала, инфицированного бактериями I-IV групп патогенности при работе методом ПЦР: Методические указания. МУ 3.5.5.1034-01 / М.: Минздрав России, 2001.

42. Олсуфьев Н.Г. Таксономия, микробиология и лабораторная диагностика возбудителя туляремии. М., 1975. – 194 с.

43. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам: Методические указания МУК 4.2.1890-04. – М., 2004. – 92 с.

44. Определитель бактерий Берджи / Девятое издание. I том. Перевод с английского под ред. Г.А. Заварзина. – М.: «Мир». – 1997. – 180-294 с.

45. Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенности: МУ 1.3.1794-03. – Федеральный центр ГСЭН Минздрава России. – М., 2003.

46. Организация и проведение эпидемиологического надзора в природных очагах чумы на территории Российской Федерации: Методические указания: МУ 3.1.1098-02. – М., 2009. – 103 с.

47. Особенности методических приемов при работе с возбудителями инфекционных болезней человека I и II группы патогенности бактериальной этиологии: Руководство / Сост. В.С. Уралева, М.М. Гулида, С.А. Лебедева и др. – Ростов-н/Д, 1989. – 208 с.

48. Правила сбора, хранения и удаления отходов лечебно-профилактических учреждений: СанПиН 2.1.7.728-99. – М.: Минздрав России. – 1999.

49. Поздеев О.К. Медицинская микробиология под ред. В.И.Покровского //- 4-е изд., испр. – М., ГЭОТАР-Медиа, 2008. -768 с.

50. Поздеев О.К. Энтеробактерии: руководство для врачей // М., ГЭОТАР-Медиа, 2007. - 720 с.

51. Порядок организации и проведения лабораторной диагностики холеры для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней: МУК 4.2.2870-11.

52. Порядок выдачи санитарно - эпидемиологического заключения о возможности проведения работ с возбудителями инфекционных заболеваний человека I-IV групп патогенности (опасности), генно-инженерно-модифицированными микроорганизмами, ядами биологического происхождения и гельминтами: Санитарные правила. СП 1.2.1318-03. – М.: Минздрав России, 2003.

53. Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности: СП 1.2.036-95.

54. Практикум по иммунологии / Под ред. И.А Кондратьева и А.А. Ярилин. Москва: ECADEMA, 2004. – 272 с.

55. Практикум по микробиологии // Под ред. Нетрусова. – Москва, 2005. – 603 с.

56. Профилактика и лабораторная диагностика бруцеллеза людей: Методические указания: МУ 3.1.7.1189-03. – М., 2003.-47с.

57. Профилактика холеры. Общие требования к эпидемиологическому надзору за холерой на территории Российской Федерации: СП 3.1.1.2521-09.

58. Профилактика холеры. Организационные мероприятия. Оценка противоэпидемической готовности медицинских учреждений к проведению мероприятий на случай возникновения очага холеры: МУ 3.1.1.2232-07.

59. Руководство по медицинской микробиологии. В 2-х томах под ред. А.С. Лабинской, Е.Г. Володиной // М., Изд-во БИНОМ, 2008. (2010).

60. Руководство по профилактике чумы под ред. проф. А.В. Наумова, проф. Л.В. Самойловой. – Саратов, 1992. – 278 с.

61. Сибирская язва / Н.П. Буравцева [и др.] // Лабораторная диагностика возбудителей опасных инфекционных болезней. – Саратов, 1998. – Т. 7. – С. 50–89.

62. Тучков И.В. Конструирование и внедрение в практику генодиагностической тест-системы для выявления ДНК воз­будителя сибирской язвы // Автореф. дис. … канд. мед. наук: 03.00.07, 03.00.15 / Рос. противочум. ин-т «Микроб». – Саратов, 2005. – 19 с.

63. Частная медицинская микробиология с техникой микробиологических исследований под ред. А.С. Лабинской, Л.П. Блинковой, А.С. Ещиной. – М., Медицина, 2005. – 600 с.

64. Чернышева М. И. и др.Использование кислого антигена роз-бенгал в плас­тинчатой реакции агглютинации при бруцеллезе у людей // Журнал микробиоло­гии, эпидемиологии и иммунобиологии — 1980 — № 6 — С. 84—88.

65. Энтеробактерии / Руководство для врачей под ред. В.И. Покровского. – М.: «Медицина», 1985. – 319 с.

66. Яковлев А.Т., Зыкин Л.Ф., Рыбкин В.С. Иммуноферментный анализ в микробиологии. – Изд. Саратовского университета. – 1990. – 92 с.