Лабораторная диагностика чумы у человека

Лабораторные исследования на чуму проводят специализированные лаборатории, имеющие лицензию на данный вид деятельности.

Объектами для исследования от людей (больных, контактных) и трупов являются:

- отделяемое язвы или пунктат из карбункула, везикулы (кожная форма);

- содержимое бубона (бубонная форма);

- мокрота, слизь из зева и мазок с миндалин (легочная форма);

-испражнения (кишечная форма);

- кровь (все формы);

- в зависимости от поражений отдельных органов и систем - моча при наличии в ней крови, спинномозговая жидкость - при менингиальных явлениях (табл. 25).

Таблица 25

Способы забора материала

 

Материал	Способы забора
Пунктат из бубона	Забирают стерильно шприцем емкостью не менее 5 мл. Пораженный участок и окружающую его ткань обрабатывают 70 °-ным этиловым спиртом, затем 5 %-ным раствором йода и вновь спиртом. Иглу осторожно вводят с таким расчетом, чтобы ее острие достигло центральной части бубона. Затем, оттянув до отказа поршень, медленно вытягивают иглу. После извлечения иглы из бубона через нее набирают в шприц 0,5 мл стерильного питательного бульона, содержимое выливают в стерильную пробирку и закрывают резиновой пробкой.
Содержимое везикулы (пустулы)	Иглу вводят у края образования и медленно продвигают в центр.
Пунктат из язвы и карбункула	Пунктируют плотный край.
Вскрывшийся бубон	Забирают материал отдельно из периферической плотной части и отделяемое свища.
Слизь из зева	Забирают стерильным ватным тампоном.
Мокрота	Забирают в стерильную широкогорлую стеклянную банку с притертой пробкой или крышкой.
Испражнения	То же.
Моча	То же.
Кровь	10 мл крови берут стерильным шприцем и 5 мл засевают у постели больного во флакон с 50 мл бульона и на чашки с плотной питательной средой.
От трупа кусочки пораженных органов	Забирают в стерильные широкогорлые стеклянные банки с притертыми пробками или крышками.

 

Посевы взятого материала желательно проводить у постели больного. Время от момента взятия материала и до начала его исследования не должно превышать 5-6 ч, если нет условий для хранения его на холоде. С целью сохранения материала можно использовать транспортную среду Кери-Блэра, консерванты Берлина и Башевой, жидкость Брокэ.

Лабораторное исследование на чуму начинается одновременно бактериоскопическим, бактериологическим, биологическим, иммуносерологическим и генетическим методами. Наряду с классической схемой лабораторного исследования выполняются экспресс-методы, позволяющие дать предварительный положительный ответ в течение 2-5 ч от начала исследования материала. К методам экспресс-диагностики относятся: иммунофлуоресцентный анализ, ПЦР, иммуно-суспензионные методы: система 2-3-компонентных реакций с эритроцитарными диагностикумами, иммуноферментный анализ, дот-иммуноферментный анализ, радиоиммунный анализ. Все экспресс-методы выполняются только после обеззараживания материала. Экспресс-методы используют на всех этапах исследования материала (нативный материал, после подращивания, материал от «биопробных» животных, при идентификации культуры).

Из доставленного материала готовят мазки с окраской по Граму и метиленовым синим. При обнаружении первых случаев заболеваний подозрительных на чуму или трупа человека готовят не менее 6-8 мазков (один окрашивают метиленовым синим, второй – по Граму, третий – чумной люминесцирующей сывороткой, остальные оставляют неокрашенными для повторных исследований). Наличие типичных для заболевания чумой клинических проявлений и обнаружение в мазках биполярных грамотрицательных палочек овоидной формы дает право поставить предварительный диагноз - подозрение на чуму. Выявление специфически светящихся микробов, окрашенных чумной люминесцирующей сывороткой, подтверждает предварительный ответ.

Для посева необходимо использовать среды, имеющие регистрационное удостоверение Росздравнадзора и разрешенные к применению в РФ. Из отечественных сред – питательная среда для выделения и культивирования чумного микроба сухая, выпускаемая ФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора», и среды зарубежного производства, разрешенные к применению согласно методическим рекомендациям (МР 02.0-06) РосНИПЧИ «Микроб» производства компании HiMediaLaboratoriesPvtLtd.

Незагрязненный посторонней микрофлорой материал (пунктат из бубона, карбункула, содержимое пустулы, везикулы, кровь и т.д.) засевают на плотные и жидкие питательные среды. Материал, содержащий постороннюю микрофлору (мокрота, слизь из зева, вскрывшийся бубон, содержимое язвы), засевают на плотные среды с ингибитором посторонней микрофлоры. Пунктат из бубона, везикулы наносят бактериологической петлей или пастеровской пипеткой на чашку агара и распределяют его шпателем или петлей частыми штрихами, оставшийся материал вносят в пробирку с бульоном.

Жидкую мокроту (особое внимание уделяют участкам с прожилками крови) петлей (2-3 петли) или пастеровской пипеткой с широким капилляром наносят на поверхность агара, растирают шпателем или частыми штрихами петлей. Затем без обжигания переносят на вторую и третью чашки плотного агара. Если мокрота вязкая, то ее комочек захватывают стерильным пинцетом, переносят на поверхность агара и тщательно растирают шпателем или частым штрихом бактериологической петлей сначала в первой, затем во второй чашке.

Слизь из зева засевают ватным тампоном, остатки материала промывают в 1мл жидкой питательной среды и используют для заражения биопробных животных. Сгусток крови (если посев не сделан у постели больного) из пробирки осторожно переносят в чашку Петри, разрушают его целостность стерильными препаровальными иглами, затем жидкую часть крови набирают в пипетку, засевают во флаконы с бульоном и 0,1 мл - на агаровую пластину, рассевая частым штрихом. Посевы инкубируют в термостате при 28 °С, а для обнаружения фракции FI - при 37 °С.

В первый день исследования с нативным материалом целесообразно ставить пробы с чумным бактериофагом ускоренным методом (приложение) и на чувствительность к антибактериальным препаратам дискодиффузионным методом (прямым посевом нативного материала сплошным газоном на чашку Петри). Это позволит при значительном числе клеток возбудителя чумы в материале получить результат чувствительности к антибиотикам через 20-24 ч с момента исследования, а не через 36-40 ч, как при постановке пробы на чувствительность к антибиотикам стандартизированным методом. Для выбора антибиотиков необходимо обратиться к схемам применения антибактериальных препаратов при экстренной профилактике чумы.

Биологическая проба является обязательной, так как не только повышает вероятность выделения культуры, но и необходима для ее идентификации. Ставят на морских свинках и/или белых мышах. Метод введения исследуемого материала зависит от характера материала. Незагрязненный материал вводят животным подкожно (0,5 мл морским свинкам и 0,2 мл белым мышам) или для ускорения гибели биопробного животного - внутрибрюшинно (0,5-1,0 мл морским свинкам и 0,3-0,5 мл белым мышам). Мокротой, слизью из зева, гноем из открытого абсцесса заражают накожным методом. В зависимости от метода введения, животное погибает на 3-9-й день. Ускорить постановку диагноза позволяет введение части биопробных животных (1 морской свинке и 1 белой мыши) гидрокортизона за 2 ч до заражения в дозе 5 мг (в 0,5 мл 0,85 %-ного хлористого натрия) под кожу области бедра. Животных с пониженной резистентностью вскрывают на первые сутки - одну белую мышь, на третьи сутки – морскую свинку. Остальных вскрывают на шестые сутки. Чувствительность биопробных животных также можно повысить, если исследуемый материал ввести с желтком куриного яйца. У животных, погибших от чумы в результате подкожного или накожного заражения, в месте введения наблюдают полнокровие, серозно-геморрагическое пропитывание тканей, нагноение, некроз. Лимфатические узлы увеличены, гиперемированы, часто инфильтрированы геморрагическим экссудатом, могут быть плотными или размягченными, окружающие ткани пропитаны студневидной серозно-геморрагической или гнойно-геморрагической жидкостью. В тканях узла могут быть очаги некроза или нагноения. В селезенке, печени, легких наблюдаются единичные или множественные узелки сероватого цвета. Узелки могут быть точечными или достигать величины булавочной головки. Вокруг некоторых из них наблюдаются венчики гиперемии. В легких могут быть очаги кровоизлияния и участки уплотнения темно-красного или серовато-красного цвета. Селезенка, печень, надпочечники увеличены, дряблой консистенции, полнокровны, с участками некроза. Иногда в брюшной полости имеется вязкий экссудат. При накожном заражении на месте введения часто наблюдаются мелкие везикулы, окруженные зоной гиперемии, или язвочки. При внутрибрюшинном заражении развивается экссудативный перитонит с образованием фибринозно-гнойных пленок на капсуле селезенки и печени.

От погибшего животного (паренхиматозных органов, лимфатических узлов и крови) делают мазки-отпечатки, производят посевы на среды, готовят суспензию для заражения второго биопробного животного и исследования на наличие фракции I чумного микроба.

Выживших животных умерщвляют на 7 сутки и производят патологоанатомическое, бактериологическое и серологическое исследования.

Для обнаружения в нативном материале фракции I возбудителя чумы ставят реакцию пассивной гемагглютинации (РПГА) с иммуноглобулиновым и реакцию нейтрализации антител (РНАт) с антигенным эритроцитарными диагностикумами или иммунофлуоресцентный анализ с использованием чумной люминесцирующей сыворотки.

Ускоренный метод генодиагностики выполняется в течение 5-6 ч. Высокая разрешающая способность метода (1000 м.к./мл) позволяет использовать его, прежде всего, при исследовании нативного материала. Реакция выполняется на тест-системах «Ген Пест» для выявления ДНК Y. pestis методом полимеразной цепной реакции производства РосНИПЧИ «Микроб». Для постановки мультиплексной ПЦР используют праймеры, обеспечивающие специфичную амплификацию фрагментов ДНК двух генов-cafI и pla, локализованных на собственных плазмидах чумного микроба pFra и pPst, соответственно. На основании выделения в пробе ДНК возбудителя чумы (одной или двух плазмид) дается устный предварительный положительный ответ.

Через 18-24 ч. Изучают рост на плотной и жидкой питательных средах. При наличии типичного роста в бульоне делают мазки: окрашивают по Граму и метиленовым синим. С плотной питательной среды отбирают типичные колонии с целью выделения чистой культуры и ее идентификации. Учитывают результаты постановки пробы с чумным бактериофагом ускоренным методом. При сомнительном результате на 2-3 подозрительные колонии наносят чумной бактериофаг. После инкубации в термостате в течение 10-12 ч проводят учет результатов пробы с чумным бактериофагом. Лизис колоний под действием чумного бактериофага подтверждает положительный ответ.

Учитывают результаты чувствительности к антибиотикам диско-диффузионным методом.

Через 36-48 ч. Выделенную культуру идентифицируют на основании следующих признаков:

1) характерная морфология микроба (микропрепараты из нативного материала и чистых культур);

2) характерная морфология роста на плотной и жидкой питательных средах;

3) чувствительность к чумному бактериофагу;

4) специфическое свечение при люминесцентной микроскопии чистой культуры;

5) наличие специфического для возбудителя чумы антигена фракции FI, выявленного в РПГА или РНАт;

6) ферментативная активность (глицерин, мочевина, рамноза, сахароза, глюкоза и др.);

7) одновременно с идентификацией проводят определение чувствительности к антибиотикам стандартизованным дискодиффузионным методом и методом серийных разведений в агаре или бульоне.

Через 60-72 чпроизводят учет результатов идентификации по следующим тестам:

- чувствительность к чумному бактериофагу и антибиотикам;

- наличие FI, выявленной методом флуоресцирующих антител и в РПГА-РНАт.

Для дальнейшей дифференциации выделенной культуры ставят тест на наличие пестицин-фибринолизин-плазмокоагулазной активности и ПЦР для детекции плазмид pFra и pPst.

Диагноз чумы у человека ставится на основании выделения у него культуры возбудителя чумы и ее идентификации, а так же при обнаружении специфического для чумного микроба антигена FI и специфических антител к антигену FI в сыворотках больных и переболевших.

Занятие 13.