Исследование материала от больного для выявления днк возбудителя сибирской язвы при помощи метода пцр

Материал от больного - содержимое карбункула - отбирают (с соблюдением правил забора клинического материала) стерильной платиновой петлей или пастеровской пипеткой в количестве 0,1-1,3 мл. Кожные элементы предварительно очищают ватным тампоном, смоченным спиртом или эфиром. Материалом для исследования могут быть также пробы из внешней среды - почва, смывы с поверхностей, а также суспензии органов павших животных и клеточные взвеси (10⁶-10⁸ м.к./ мл) при идентификации выделенных культур.

Для обеззараживания материала, содержащего спорообразующие мик­роорганизмы, в том числе B. anthracis, применяют методический подход, заключающийся в герминации спор и последующей обработке пеницилли­ном, прогреванием и воздействии лизирующего буфера с гуани­динтиоционатом. Принцип метода состоит в прорастании спор в вегетативные клетки при культивировании их в благо­приятных условиях. Далее под действием температуры и пенициллина происходит разрушение клеточной мембраны бацилл с высвобождением ДНК. Последовательность выполнения операций следующая:

1. Для герминации спор исследуемый материал засевают в количестве 0,1 мл в пробирки с 0,9 мл бульона Хоттингера рН 7,6 и инкубируют с встряхиванием при температуре 37 °С в течение 2,5 ч.

2. В пробирки с материалом добавляют пенициллин в расчете 1000 ЕД/мл, инкубируют при 37 °С в течение 15 мин, затем прогревают на водяной бане при температуре 100°С в течение 10 мин.

3. Из проб отбирают по 100 мкл материала в микроцентрифужные пробирки типа Эппендорф, добавляют по 300 мкл лизирующего буфера с гуанидинтиоцианатом и прогревают при температуре 65 °С в течение 15 мин.

После выполнения процедур 1-3 этапов материал для исследования считается обеззараженным, при этом не повреждается ДНК и в последующем не ингибируется ПЦР.

Для выделения ДНК из материала, обеззараженного как описано выше, используют набор реагентов, производимый РосНИПЧИ «Микроб», или аналогичный (НПФ «Биоком», «ДНК-технология» или ЗАО «ВекторБест»).

Для постановки ПЦР используется тест-система для выявления ДНК B. anthracis рХО1, выпускаемая РосНИПЧИ «Микроб». Видоспецифичные праймеры выбраны на основе нуклеотидной последовательости гена pag, кодирующего протективный антиген токсинного комплекса и локализованного на плазмиде рХО1.

Тест-систему извлекают из морозильной камеры, размораживают содержимое пробирок (для этого лучше использовать ледяную баню или охладитель проб). После траспортировки или длительного хранения пробирки центрифугируют 20 сек (для осаждения капель со стенок) и тщательно перемешивают на вортексе.

Готовят реакционную смесь в специально предназначенной для этого пробирке из расчета на одну пробу: 10х ПЦР-буфер - 2,5 мкл, раствор дНТФ - 2,5 мкл, праймеры ВА1 и ВА2 - по 1 мкл, Таq-полимераза - 0,2 мкл, вода деионизованная - 7,8 мкл.

Фермент в реакционную смесь вносят в последнюю очередь и оставляют его вместе с наконечником в пробирке. Затем в наконечник вставляют дозатор, настроенный на 15 мкл, реакционную смесь тщательно перемешивают не только круговыми движениями наконечника, но и поступательными движениями поршня дозатора (пипетированием). По окончании перемешивания в каждую пробирку, включая контроли, добавляют по 15 мкл реакционной смеси, после чего вносят по одной капле вазелинового масла (для предотвращения испарения реакционной смеси при термоциклировании.). В пробирку, обозначенную как отрицательный контроль (-), вносят 10 мкл деионизованной воды, а в пробирку, обозначенную как положительный контроль (+), - 10 мкл контрольной ДНК (специально предназначенным для этого дозатором!). Пробы в объеме 10 мкл вносят (также предназначенным для этого дозатором) под минеральное масло. По мере заполнения пробирки закрывают, нумеруют, помещают в амплификатор и термоциклируют по программе: предварительная денатурация при 94 ºС (1 цикл) - 3 мин, затем 35 40-секундных циклов при 94, 49 и 72 ºС. В заключение проводят 1 цикл при 72 ºС в течение 10 мин.

После первого этапа амплификации для повышения чувствительности и специфичности реакции проводят вторую стадию. Реакционную смесь готовят из расчета на одну пробу: 10х буфер - 2,5 мкл, раствор дНТФ - 2,5 мкл, праймеры ВА3 и ВА4 - по 1 мкл каждого, фермент Taq-полимераза - 0,2 мкл, вода деионизованная - 16,8 мкл. Далее реакциионную смесь разливают по 24 мкл в каждую пробирку, наслаивают на нее по одной капле вазелинового масла и под масло вносят по 1 мкл амплификата, полученного после первого этапа реакции. Термоциклирование на втором этапе проводят по следующей программе: 1 цикл - 1 мин при 94 ºС, 25 40-секундных циклов при 94, 49 и 72 ºС и 1 цикл при 72 ºС в течение 10 мин.

Наиболее простой метод выявления продукта ферментативной амплификации ДНК в ПЦР - электрофорез в агарозном геле. По окончании программы амплификации анализируемые образцы смеши­вают с 2,0-2,5 мкл раствора для нанесения проб и вносят в лунки горизонтального агароз­ного геля. Для более четкого разделения амплифицированных фрагментов целесообразно использование агарозного геля плотностью 1,3 %. Электрофорез проводят в 1хТВЕ-буфере в присутствии бромистого этидия в концен­трации 0,5 мкг/мл при напряженности 6 В/см в течение 1 ч, не допуская выхода бромфенолового синего из геля. Затем гель просматривают в ультрафиолетовом свете на транс-иллюминаторе и результат фоторе­гистрируют.

Амплифицированные фрагменты ДНК идентифици­руют по размеру, срав­нивая флуоресцирующие в геле полосы анализируемых образцов с полосами положитель­ного контроля или в соответствии с маркерами молекулярного веса.

Оценка результатов ПЦР:

- положительный контроль - выявляется полоса фрагмента 154 п.н.;

- отрицательный контроль - полоса на уровне положительного контроля отсутствует

- анализируемые пробы: наличие полосы на уровне положительного контроля (154 п.н.) указывает на присутствие ДНК возбудителя в исследуемом материале,

- наличие полос выше или ниже положительного контроля является неспецифичным ответом и во внимание не принимается.

Приложение