Биологические свойства возбудителя бруцеллеза

Возбудитель бруцеллеза относится к роду Brucella, который входит в группу грамотрицательных, аэробных/микроаэрофильных палочек и кок­ков к альфа 2 подгруппе класса Proteobacteria. Бруцеллы являются грамотрицательными, факультативными внутриклеточными патогенами, вызывающими заболевание у большого числа животных и человека. Род Brucella состоит из 7 самостоятельных видов, различающихся по биохими­ческим, метаболическим, антигенным и вирулентным характеристикам: Brucella melitensis (преимущественно поражает коз и овец), Brucella abortus (преимущественно вызывает заболевание у крупного рогатого скота), Bru­cella suis (преимущественно инфицирует свиней), Brucella neotomae (вызы­вает поражение кустарниковый крыс), Brucella ovis (вызывает эпидидимиты у баранов), Brucella canis (инфицирует собак) и недавно выделенный вид - Brucella maris (поражает морских млекопитающих). Некоторые виды бруцелл подразделяют на биовары. Для В. melitensis известны 3 биовара, для В. suis - 5 биоваров, и 7 биоваров для В. abortus. В. maris подразделяют на 2 биовара - cetaceae (выделяют от китообразных) и pinnipediae (выделяют от ластоногих).

Морфологически все виды и биовары бруцелл не отличаются друг от друга. Они имеют вид мелких нежных палочек, овоидной или слегка удлиненной формы. При сравнительном изучении морфологии бруцелл в электрон­ном микроскопе клетки В. melitensis преимущественно имеют кокковидную форму, В. abortus и В. suis - палочковидную. Размер бруцелл кокковидных форм 0,3-0,6 мкм, палочко­видных - 0,6-1,5 мкм.

Расположение бруцелл в мазках чаще всего беспорядоч­ное, отмечается более или менее выраженный полиморфизм. Бруцеллы неподвижны, спор не образуют, при определенных условиях (воздействие специфическим бактериофагом, выращи­вание на средах с добавлением 10 % иммунной сыворотки и др. формируют капсулу. Они грамм-отрицательны, при окраске по методу Козловского - розового цвета. Оптимальной темпе­ратурой культивирования бруцелл является 37 °С, максимальный рост наблюдается при рН 6,8-7,2.

Отдельные биовары В. abortus и некоторые представители В. ovis в отличие от В. suis и В. melitensis в первых генерациях требуют для своего роста повышенного (5-10 %) содержания С0₂.

Культуры бруцелл, особенно первые генерации, характери­зуются замедленным темпом роста на питательных средах, поэто­му посевы инфицированного материала от человека и животных инкубируют при 37 °С в течение 10-30 суток. Лабораторные штаммы при пересевах развиваются быстрее, но и у них фаза в среднем составляет 18-30 часов. Бруцеллы хорошо растут на печеночных средах, агаре Мартена, Альбими, эритрит-агаре, сухом агаре «Д», на мясопептонном агаре с добавлением глюкозы и глицерина.

Молодые колонии бруцелл в S-форме на агаре выпуклые, круглые с ровными краями и гладкой поверхностью, при про­смотре в падающем свете - белесоватые, проходящем - янтарно-желтые. Величина колоний может в значительной степени колебаться. На 7-10 сутки выращивания колонии становятся крупными, сохраняют прозрачность, уплощаются. Под микроскопом коло­нии гомогенные с нежной зернистостью в центре.

Культуры бруцелл при посеве штрихом на скошенный агар образуют нежный, прозрачный, блестящий, влажный, постепен­но грубеющий налет маслянистой консистенции. При выращи­вании бруцелл в бульоне наблюдается равномерное помутнение среды. В старых бульонных культурах отмечается пристеночный кольцевидный рост.

Культуры бруцелл при длительном культивировании на плот­ных и, особенно, жидких питательных средах и при неблагоприят­ных условиях роста диссоциируют. Известны R-шероховаты, L- и промежуточные формы колоний. При диссоциации у культур изменяются агглютинабельные, биохимические свой­ства, вирулентность и антигенная структура (табл. 26).

Выделение культуры предварительно проверяют на наличие признаков диссоциации, изучая рост в бульоне, форму колоний, эмульгируемость в физиологическом растворе, прижизненную окраску колоний кристаллическим фиолетовым, термопреципи­тацию и пробу с трипафлавином.

Таблица 26

Характеристика S-, R-, и L- форм бруцелл

Признаки	S-форма	R-форма	L-форма
Рост на агаре	Нежный, влажный	Более грубый	Голубовато-серый налет
Колонии	Круглые, выпуклые, пра вильно контурированные,- гомогенные или нежно зернистые, поверхность гладкая, блестящая	Круглые, менее выпуклые, иногда с ровными краями, грубозернистые, поверх- ность неровная, матовая	Мелкие, до 2-3 мм, круглые колонии, часто врастают в агар, слизистые или крошковидные. Под микроскопом имеют вид яичницы- плотный центр и более светлые края
Рост в бульоне	Гомогенный, без про­светления	Зернистый, хлопчатый с осадком и просветлением	Резко выраженный полиморфизм при фазово-контрастном микроскопировании. Клетки увеличенные в виде шаров, грушеподобной формы, колец, запятых, нитей, неправильной формы
Суспендируемость в физиологическом растворе	Взвесь равномерная, стойкая	Взвесь хлопчатая, нестойкая	Плохая, взвесь крошковидная или тяжами
Агглютинабельность с S-сывороткой	До титра сыворотки	Неспецифическая в фи­зиологическом растворе	У стабильных L-форм отсутствует
Вирулентность	Высокая	Часто резко ослабленная	Низкая
Проба на диссациацию	Отрицательная	Положительная	Положительная

 

С диссоциированными культурами проводят дополнительные исследования, подтверждающие их принадлежность к роду Brucella. К ним относят ориентировочную реакцию агглютинации с сывороткой анти-R или посев выделенной культуры на глюкозо-глицериновом агаре; с хлористым кальцием, на котором вокруг роста культуры бруцелл, независимо от состояния диссоциации, образуется белая зона.

Бруцеллы продуцируют каталазу, уреазу, гиалуронидазу, пероксидазу, амилазу, липазу, фосфатазу, цитохромоксидазу и некоторые другие ферменты.

При росте на питательных средах в процессе метаболизма бруцеллы образуют сероводород, интенсивность выделения ко­торого у отдельных видов и биоваров выражена по-разному.

Бруцеллы чувствительны к бактериостатическому действию некоторых красителей. Установлено, что красители вступают в связь с питательным субстратом среды, изменяют ее и среда становится неблагоприятной для роста культуры. Различные виды и биовары бруцелл обладают разной степенью чувстви­тельности к анилиновым краскам.

Известны несколько типов вирулентных бруцеллезных бак­териофагов (Tb, Wb, Fi, BK₂), сходных по морфологии, сероло­гии и спектру литического действия.

Бруцеллы обладают выраженными антигенными свойствами. Установлено, что количество специфических антигенов А и М, присущих S-формам бруцелл, у каждого вида неодинаково. У В. melitensis количественное отношение А антигена к М 1:20, а у В. abortus - 20:1. Различие в антигенной структуре бруцелл удается выявить с помощью моноспецифических сывороток антимелитензис и антиабортус (табл. 27). На основании изучения биохимической активности и антигенной структуры бруцелл исследователи предлагают различные тесты как для идентифи­кации рода бруцелл, так и для дифференциации отдельных видов и биоваров (табл. 27).

Бруцеллы обладают устойчивостью к воздействию низких температур и малоустойчивы к высокой температуре. В жидких культурах при 60 °С они погибают через 30 минут, при 80-85 °С - через 5 минут, при кипячении - моментально. На бруцеллы губительно действует прямой солнечный свет. Различные дезинфицирующие вещества – 2 % раствор карбо­ловой кислоты, 3 % раствор лизола, 0,2 % раствор хлорной извести, 0,01 % раствор хлорамина, 0,1 % раствор сулемы - убивают их течение нескольких минут.

Таблица 27

Дифференциальные свойства видов и биоваров рода Brucella

Вид	Биовар	Потребность в СО2	Продукция H2S	Рост на средах с красками	Агглютинация с моноспецифич.сыворотками	лизис фагом "ТБ" RTD	основной хозяин
тионин	Осн. фуксин	А	М	R
В.abortus		(+)	+	-	+	+	-	-	Л	крупный рогатый скот
	(+)	+	-	+	+	-	-	Л
3 <*>	(+)	+	+	+	+	-	-	Л
	(+)	+	-	(+)<**>	-	+	-	Л
	-	-	+	+	-	+	-	Л
6<*>	-	(+)	+	+	-	+	-	Л
	-	+	+	+	-	+	-	Л
В.melitensis		-	-	+	+	-	+	-	ОЛ	Овцы, козы
	-	-	+	+	-	+	-	ОЛ
	-	-	+	+	+	+	-	ОЛ
В.suis		-	+	+	(-)<***>	+	-	-	ОЛ	свиньи
	-	-	+	-	+	-	-	ОЛ	свиньи, зайцы
	-	-	+	+	+	-	-	ОЛ	свиньи
	-	-	+	(-)	+	+	-	ОЛ	Олени
	-	-	+	-	-	+	-	ОЛ	мышевидные грызуны
B.neotomae		-	+	-	-	+	-	-	ОЛ или ЧЛ	Пустынные кустарниковые крысы
В.ovis		+	-	+	(-)	-	-	+	ОЛ	овцы
В.canis		-	-	+	-	-	-	+	ОЛ	собаки
Л - полный лизис, ЧЛ - частичный лизис, ОЛ - отсутствие лизиса. + (+) большинство штаммов положительные, (-) большинство штаммов отрицательные.
<*> Для более точной дифференциации B.abortus биовар 3 и 6 используется тионин 1:25000 (биовар 3+, биовар 6-). <**> Некоторые штаммы этого биовара (биовар 4) ингибируются основным фуксином. <***> Некоторые штаммы могут быть резистентны к основному фуксину, пиронину и сафронину О.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ЗАНЯТИЯ

Работа со штаммами бруцелл является одной из наиболее опасных. С куль­турами этих микроорганизмов и материалом, содержащим их, следует обращаться с тщательной предосторожностью. Рекомендуется все манипуляции с живыми культурами бруцелл проводить только в боксах максимальной защиты или в по­мещениях с вытяжной защитной вентиляцией в полном противочумном костюме. Обеззараживание объектов, инфицированных возбудителем бруцеллеза, осу­ществлять автоклавированием. Петли, шпатели обеззараживать на огне. Защит­ные боксы дезинфицировать парами формальдегида или орошением 3 % раство­ром перекиси водорода.

Работу с вирулентными культурами, особенно с В. melitensis, следует свести до минимума, там, где возможно заменить авирулентными.

Занятие 1.

Изучение культурально-морфологических и агглютинабельных свойств В. abortus 19 ВА

• Изучение характера роста культуры на скошенном агаре.
• Изучение морфологии колоний на пластинчатом агаре.
• Изучение характера роста культуры бруцелл в бульоне Хоттингера.
• Изучение морфологии микробов в мазках.
• Приготовление 2 мазков из бульонной культуры, фиксация; окрашивание одного мазков по Граму, второго - люминесцирующей бруцеллезной сывороткой.
• Постановка ориентировочной реакции агглютинации с бруцеллезной агглютинирующей сывороткой.