Бактериологический диагноз сальмонеллеза

· Исследование испражнений и крови больного. Окончание исследования.

· Учет результатов роста культур в средах минимального дифференцирующего ряда, на скошенном МПА.

· Учет пробы с сальмонеллезным бактериофагом.

· Серологическая идентификация выделенной культуры по схеме Кауфмана-Уайта.

· Учет чувствительности выделенной культуры к антибиотикам.

· Заключение, выдача результата исследования испражнений больного.

· Заполнение паспорта на выделенные культуры.

 

Занятие 17 (демонстрационное).

Определение генотипа, ассоциированного с патогенностью salmonella sp., методом полимеразной цепной реакции

В качестве одной из стабильных и перспективных мишеней в ДНК сальмонелл при использовании молекулярно-диагностических методов экспресс-диагностики (ПЦР и ДНК-зондирование) и анализа потенциальной патогенности штаммов выбран и используется фрагмент гена инвазивности inv, расположенный в пределах «острова патогенности» SP-I на хромосоме бактерий Salmonellae sp. Наличие данного гена (или всего «острова патогенности») у тестируемого штамма свидетельствует о наличии у него инвазивных свойств и потенциальной патогенности.

· Приготовление суспензии 10⁷ КОЕ/мл в дистиллированной Н₂О из «чистой» культуры анализируемых штаммов сальмонелл.

· Проведение термоинактивации и экстракции тотальной ДНК сальмонелл путем прогревания суспензии микробов при 100 ^оС в течение 15 мин.

· Приготовление 1,4 % агарозного геля и трис-боратного буфера для гель-электрофореза.

· Осуществление программирования амплификатора «Терцик» для ПЦР-детекции гена инвазивности (inv) сальмонелл.

· Подготовка реакционной смеси для постановки ПЦР и осуществление амплификации проб на термоциклере.

· Выполнение гель-электрофореза ампликонов и учет результатов ПЦР.

· Предварительное заключение о патогенности изучаемой культуры.

ПЦР проводят только в одноразовых микропробирках с использованием одноразовых наконечников для внесения всех компонентов амплификационной смеси. Устанавливают в штатив и маркируют пробирки для амплификации по числу ис­следуемых проб и две дополнительные пробирки (положительный и отрицательный кон­троли).

На одну пробу объемом 25 мкл готовят амплификационную смесь следующего состава:

1. 2 мкл 10х ПЦР-буфера;

2. 1 мкл 2,5 мМ раствора дНТФ;

3. 1 мкл БСА;

4. Дистиллированная вода до - 20 мкл;

5. 5-10 пкм каждого праймера (по 1 мкл);

6. 0,2 мкл Таq-ДНК-полимеразы.

Приготавливают общую амплификационную смесь на все число проб и две пробы (положительный и отрицательный контроли). Перемешивают полученную смесь пипетированием и вносят в амплификационные пробирки по 20 мкл в каждую. Исследуемые образцы тотальной ДНК сальмонелл в количестве 5 мкл вносят в амплификационные смеси с помощью отдельных наконечников для каждого образца, после чего смесь перемешивают пипетирова­нием и наслаивают 40-50 мкл вазелинового масла (три капли из наконечника объемом 200 мкл). В каче­стве положи­тельного контроля применяют 2 мкл образца ДНК, экстрагированной методом кипячения из суспензии клеток штаммов S. typhimurium 4244или другого вирулентного тест-штамма сальмонелл, с концентрацией 1·10⁷ КОЕ. В качестве от­рицательного контроля используют 5 мкл дистиллированной воды. Пробирки закрывают и помещают в амплификатор со следующей темпе­ратурно-временной программой:

«горячий» старт – 94 °С - 3 мин, затем 35 циклов: денатурация при температуре 94 °С - 1 мин, «отжиг» 50 °С - 1 мин, элонгация цепи при 72 °С - 1 мин; завершающий этап при 72 °С - 5 мин.

После амплификации препараты смешать с 3 мкл лидирующего красителя - бромфенолового синего. Для проведения электрофореза используется заранее приготовленный 1,4% агарозный гель. Гель-электрофорез проводится в трис-боратной буферной системе в течение 30 мин при напряжении 10 v/см. Визуализацию продуктов ПЦР осуществляют окрашиванием геля в течение 10 мин бромистым этидием в кoнцентрации 0,5 мкг/мл и видеорегистрацией результатов электрофореза цифровой камерой при помощи УФ-трансиллю-минатора с длиной волны 260-300 нм.

В положительных образцах должна наблюдаться интенсивно окрашенная полоса ампликонов ДНК, соответствующая размеру 240 п.н.

 

6.5. Приложение