Лабораторная диагностика энтеробактериозов

Прежде, чем приступить к работе с возбудителями особо опасных инфекций (чума, туляремия, холера, сибирская язва, бруцеллез), слушателям предлагается изучение биологических свойств представителей родовых групп семейства Enterobacteriaceae, атакже современных методов обнаружения, выделения и идентификации наиболее значимых в патологии человека микроорганизмов основных родов: Escherichia, Shigella и Salmonella.

6.1. Характеристика семейства Enterobacteriaceae

Название семейства Enterobacteriaceae (enteron - кишка) связано с тем, что средой обитания для большинства бактерий является кишечный тракт позвоночных животных и человека. В организме человека многие энтеробактерии находятся в состоянии микробных биоценозов толстой и тонкой кишок. При изменении условий существования они могут вызывать заболевания. Это так называемые условно-патогенные бактерии. Патогенные виды встречаются только у больных и бактерионосителей. С испражнениями людей и животных энтеробактерии попадают в окружающую среду, где могут сохраняться длительное время.

Микроорганизмы, принадлежащие к семейству энтеробактерий, многочисленны и разнообразны по биологическим свойствам. Их классификация и номенклатура многократно подвергались и подвергаются ревизии, дополнениям и изменениям.

Согласно определителю бактерий Берджи (1997 г., перевод 9-го американского издания 1994 г.), семейство Enterobacteriaceae включает в себя 31 род, среди которых Escherichia, Shigella, Salmonella, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter, Hafnia, Serratia, Morganella, Proteus, Yersinia, Edwardsiella и другие. Основными свойствами, характеризующими семейство энтеробактерий, являются палочковидная форма (ширина - 0,3-1,0, длина - 1,0-6,0 мкм), наличие общего антигена Кунина, грамотрицательная окраска, расщепление глюкозы ферментацией, способность восстанавливать нитраты в нитриты (за исключением некоторых штаммов Yersinia, Erwinia), наличие каталазы (кроме S. dysenteriae серовара 1), отсутствие оксидазы и способности к спорообразованию, содержание Г+Ц в ДНК - 39-59 моль%.

Идентификация энтеробактерий по родам осуществляется на основе морфологических, физиологических и биохимических признаков, а также генетического анализа микроорганизмов. Особое место отводят ферментативным свойствам, так как именно они служат первоочередной основой для идентификации в пределах семейства (табл. 7). Эти свойства признаны наиболее стабильными. Для бактерий каждого рода характерен определенный спектр биохимических признаков, выявление которых технически не сложно и позволяет получать достаточно наглядные результаты. Разработана схема, включающая минимум наиболее значимых тестов (минимальный дифференцирующий ряд), необходимых для получения достоверных результатов идентификации энтеробактерий.

Таблица 7

Дифференциация родовых групп Enterobacteriaceae по биохимическим свойствам

Тест или субстрат

Esherichia

Shigella

Salmonella

Citrobacter

Klebsiella

Enterobacter

Hafnia

Serratia

Proteus

Yersinia

Edwardsiella

Erwinia

Комбинированная среда

Сероводород

-

-

+,-

+,-

-

+

-

-

+,-

-

+

-,+

Лактоза

+,-

-

-,+

х

+

+

-,+

-,+

-

-

-

х

Глюкоза(газ)

+,-

-

+,-

+

+

+

+,-

-,+

+,-

+

+

-

Мочевина

-

-

-

х

-

(+),-

-

х

+,-

+,(+)

-

-

Минимальный дифференцирующий ряд

Мочевина (по Преусу или Кристенсену)

-

-

-

х

(+)

(+),-

-

х

+,-

х

-

-

Подвижность

+,-

-

+,-

+

-

+

х

+

+,-

-

+

+,-

Индол

+,-

-,+

-

-,+

-,+

-

-

-

+,-

-,+

+

-

Фенилаланидезаминаза

-

-

-

-

-

-

-

-

+

-

-

х

Цитрат Симмонса

-

-

+,-

+

+

+

х

+

х

-

-

+

Ацетат натрия

+,(+)

-

х

х

+

+

-(+)

х

х

х

х

х

Лизиндекарбоксилаза

+,-

-

+,-

-

+

-,+

+

+

-

-

+

-

Орнитиндекарбоксилаза

х

-,+

+

х

-

+

+

+

-,+

х

+

-

Среда Кларка

Реакция с метиловым красным

+

+

+

+

-,+

-

+

х

+

+

+

-

Реакция Фогес-Проскауэра

-

-

-

-

+,-

+

х

х

-

-

-

х

Сорбит

х

х

+

+

+

+

-

+

-,+

х

-

х

Примечание: + положительная реакция; (+) замедленно положительная реакция (позже 24 ч); - отрицательная реакция; х - различные результаты реакции

 

При установлении родовой принадлежности культур используют серологические тесты с соответствующими поливалентными сыворотками. Достаточно полно изучена антигенная характеристика таких бактерий как сальмонеллы, шигеллы, эшерихии, цитробактеры, отчасти протеи и клебсиеллы. Из числа известных антигенов энтеробактерий для идентификации имеют значение: липополисахаридные (О), жгутиковые (Н) и капсульные полисахаридные (К) антигены.

Дополнительным тестом для подтверждения принадлежности культур к патогенным энтеробактериям служат пробы с соответствующими поливалентными родоспецифическими бактериофагами. Для внутривидовой дифференциации бактерий используют серологические признаки, анализ плазмидного состава, отношение к бактериофагам и колицинам и некоторые другие тесты.

В последние годы в практике бактериологических лабораторий для экспрессной идентификации энтеробактерий все большее применение находят API-тесты, биохимический экспресс-анализатор «ATB identification» фирмы Bio-Merieux (Франция), тест-система BBL «Crystall» фирмы Becton Dickinson (Германия), а также идентификатор микроорганизмов Micro Tax фирмы SY-LAB (Австрия) и микробиологический анализатор Vitek-2 Compact (Bio-Merieux, Франция). В референс-лабораториях и научно-исследовательских учреждениях эффективно применяют методы генетических зондов и полимеразую цепную реакцию.

Одним из эффективных методов диагностики ОКИ является иммунохроматографический анализ, который доступен для исполнения у постели больного, в кабинете врача, для самодиагностики в домашних условиях. Многие зарубежные компании (Merck, Merieux) предлагают набор компонентов для экспресс-обнаружения E. coli О157, сальмонелл, кампилобактера, веротоксинов и других.

Для бактериологического исследования на энтеробактерии пригоден самый разнообразный материал. Отбор проб из клинических образцов (испражнения, кровь, моча, желчь, дуоденальное содержимое, пунктаты органов, экссудат, спинномозговая жидкость, мокрота, слизь из зева, носа, уха, отделяемое ран, секционный материал) производится с учетом локализации, патогенеза патологического процесса и стадии заболевания. Пробы из объектов окружающей среды отбирают с учетом путей и факторов передачи инфекции, сроков сохранения этих микроорганизмов в тех или иных объектах. Взятый на исследование материал должен быть посеян в течение двух часов на питательные среды. Если это не представляется возможным, то его следует поместить в консервант (глицериновый, фосфатно-буферный, изотонический раствор хлорида натрия) в соотношении 1:3.

Посевы проб исследуемого материала производят в жидкие питательные среды и на чашки с плотными селективно-дифференциальными средами.

Жидкие накопительные среды предназначены для посева материала, содержащего разнообразную микрофлору (испражнения, гнойное отделяемое, секционный материал и т.п.). Они содержат вещества, подавляющие рост сопутствующей микрофлоры. К средам, предназначенным для выделения сальмонелл, относятся селенитовый бульон, магниевая среда, среда Мюллера или Кауфмана. Исследуемый материал вносят в эти среды в соотношении 1:5 и тщательно перемешивают. Кровь засевают в среды в соотношении 1:10. Обогатительные среды для материалов, обычно не обсемененных микроорганизмами (кровь, спинномозговая жидкость), содержат только вещества, стимулирующие рост искомых возбудителей болезни. Для сальмонелл это - среда Рапопорта, желчный бульон.

Плотные высокоселективные среды (ВСА, агар Плоскирева и др.) целесообразно применять для посева испражнений и другого материала, содержащего сопутствующую микрофлору.

Для выделения условно-патогенных энтеробактерий используют слабоселективные питательные среды (среда Эндо, эозин-метиленовый агар и др.). Оптимальным является одновременное применение тех и других сред. Посевы инкубируют при 37°С в течение 18-20 ч (до 48 ч на ВСА).

Эшерихиозы

Эшерихиозы - группа инфекционных заболеваний, вызываемых микроорганизмами рода Escherichia, в большинстве случаев - E. сoli.

Заболевания протекают, главным образом, в виде инфекций желудочно-кишечного тракта, мочевыводящих путей, бактериемии и менингита новорожденных. Кишечные инфекции обусловлены диареегенными E. сoli пяти групп: энтеротоксигенными (ЭТКП), энтеропатогенными (ЭПКП), энтероинвазивными (ЭИКП), энтерогеморрагическими (ЭГКП) и энтероадгезивными (ЭАКП). Способность диареегенных E. сoli вызывать заболевания связана с наличием у них факторов патогенности:

· адгезии и колонизации (кодируется плазмидными генами);

· инвазии (белки наружной мембраны, кодируемые плазмидой м.м. 140 мДа);

· экзотоксинов (цитотонины, два типа цитотоксинов, синтез которых контролируется генами умеренных конвертирующих фагов - 933 J (SLT-I) и 933 W (SLT-II);

· эндотоксинов (липополисахариды).

ЭТКП вызывают холероподобную инфекцию у детей и взрослых. Это связано с наличием белковых энтеротоксинов, напоминающих по механизму действия холероген. ЭТКП принадлежат к сероварам О6, О8, О15, О20, О25, О27, О139 и др.

ЭПКП вызывают колиэнтериты преимущественно у детей первого года жизни. Адгезия патогена на эритроцитах происходит с участием белков наружной мембраны. В процессе развития инфекции бактерии разрушаются и освобождается эндотоксин - ЛПС, который вызывает развитие системной воспалительной реакции в тонком кишечнике больного. Колиэнтериты обусловлены ЭПКП преимущественно сероваров О44, О55, О119, О142 и др.

ЭИКП вызывают дизентериеподобные заболевания у детей и взрослых. Адгезия на эритроцитах происходит за счет капсулоподобной оболочки. Аналогично шигеллам они пенетрируют и размножаются в эритроцитах. Это приводит к гибели эритроцитов и образованию язв в толстом кишечнике. ЭИКП вырабатывают токсин, подобный токсину шигелл. ЭИКП относятся к сероварам О29, О124, О143, О144 и др.

ЭГКП (например, E. coli О157:Н7) являются представителями микрофлоры крупного рогатого скота, овец. Они вызывают диарею с примесью крови и развитие гемолитико-уремического синдрома. Патогенез диареи связан с выработкой веротоксина двух типов, один из которых (VT-1) имеет структурное и антигенное сродство с токсином S. dysenteriae серовара 1, а другой (VT-2) является цитотоксином. Токсин связывается с субъединицей 60 S рибосом, блокирует синтез белка, разрушает эндотелий мелких кровеносных сосудов, вызывает поражение почек. В некоторых случаях это приводит к летальному исходу. К ЭГКП относятся бактерии сероваров О11, О145, О157.

ЭАКП (или аутоагглютинирующие E. coli) - плохо изученная группа. Идентификация ее представителей основывается на их способности к адгезии на поверхности клеток Hep-2. Роль ЭАКП в развитии инфекций желудочно-кишечного тракта до конца не выяснена.

Кроме диареи, E. coli вызывает гнойно-воспалительные заболевания различной локализации: пиелиты, циститы, холециститы, менингит новорожденных, нагноение ран и др.При выраженном иммунодефиците E. coli может вызывать сепсис.

Морфология и физиология. По морфологическим и тинкториальным свойствам E. coli напоминает другие энтеробактерии. Среди кишечных палочек встречаются подвижные и неподвижные варианты. Бактерии некоторых штаммов имеют капсулу или микрокапсулу и формируют на плотной среде колоний в S- и R-формах. E. coli - факультативный анаэроб, хорошо растет на обычных питательных средах при слабощелочном значении рН и оптимальной температуре 37^○С.

Кишечная палочка обладает высокой ферментативной активностью, утилизирует ацетат в качестве единственного источника углерода. Большинство штаммов ферментируют лактозу с образованием кислоты и газа, что является одним из основных признаков при конструировании дифференциально-диагностических сред.

Антигены. E. coli имеет сложную антигенную структуру. Схема ее типирования основана на вариабельности соматических О-антигенов, жгутиковых Н-антигенов и капсульных (поверхностных) К-антигенов.

О-антигены имеют сходную химическую структуру и связаны с ЛПС клеточной стенки. О-антигены определяют серологическую группу эшерихий. В настоящее время описано около 170 О-серогрупп E. coli. Эшерихии разных О-серогрупп в большинстве своем характеризуются перекрестными антигенными связями. Около 100 серогрупп кишечной палочки имеют перекрестнореагирующие антигены с шигеллами, сальмонеллами и другими энтеробактериями.

У эшерихий описано 50 Н-антигенов, которые типоспецифичны. Н-ан-тигены имеются только у жгутиковых форм бактерий и состоят преимущественно из белка флагеллина.

Эшерихии содержат около 97 К-антигенов, которые подразделены на три типа - A, B и L. Они различаются чувствительностью к нагреванию и химическим веществам. К-антигены способны маскировать О-антигены, которые можно выявить только после разрушения первых кипячением культуры.

Антигены E. coli обозначают антигенными формулами, указывающими на серогруппу, например, E. coli 026:К 60 (В6), или серовар E. coli 026:К 60 (В6): Н₂.

Патогенность эшерихий для людей связана с определенными серогруппами.

Лабораторная диагностика эшерихиозов основана на бактериологическом анализе биоматериала (испражнений, рвотных масс, желчи, мочи, дуоденального содержимого, крови и др.). Исследование проводится по стандартной схеме с целью выделения культуры, ее идентификации по морфологическим и биохимическим признакам и определения серовара возбудителя.

Для посева исследуемого материала используют селективно-дифферен-цирующие среды: Плоскирева, Левина, Эндо, Аселя-Либермана. С целью вы-деления и идентификации энтерогеморрагической кишечной палочки E. coli О157:Н7 материал от больных неосложненными диареями, острыми кишечными инфекциями с гемоколитом и гемолитико-уремическим синдромом засевают на питательную среду Сорбитол E. coli О157:Н7 (агар) и в соотношении 1:5 - в среды накопления (бульон лактозный с бриллиантовым зеленым и желчью). Посевы инкубируют при 37 ^○С в течение 18-20 ч. Колонии патогенных и непатогенных эшерихий не различаются и имеют на среде Эндо круглую форму, ровный край, матовую поверхность и малиново-красный цвет; на среде Левина - темно-синий цвет; на среде Аселя-Либермана - розовую окраску при неизменности других признаков. Из 10 подозрительных колоний берут часть материала для оксидазной пробы, микроскопии и ориентировочной РА с поливалентными ОК-антисыворотками, Ig и адсорбированными О-сыворотками. При положительных результатах колонии пересевают на среду Клиглера (Олькеницкого, Ресселя) для выделения и дальнейшего изучения чистой культуры.

При просмотре посевов исследуемого материала на чашках с Сорбитол E. coli О157:Н7 агаром отбирают колонии средней величины, выпуклые, круглые, влажные, прозрачные, бесцветные (сорбитолотрицательные колонии). Если на чашках выросли 1-2 сорбитолотрицательные колонии, то серологические реакции ставят после посева на одну из сред первичной дифференциации (Клиглера, Олькеницкого, Ресселя). В случае роста однотипной культуры материал с 3-5 колоний серологически идентификацируют на стекле с О- и Н-сыворотками к антигенам E. coli О157:Н7 и не менее 5 сорбитол-отрицательных колоний пересевают на среду первичной дифференциации для последующего изучения.

Биохимическую активность выделенной культуры определяют с помощью стандартных наборов или проводят идентификацию на минимальном дифференцирующем ряду. Изучают образование индола, ставят реакции с метиловым красным и Фогеса-Проскауэра, определяют характер роста на цитратных агарах Симонса или Кристенсена, среде с малонатом, агаре с фенилаланином, средах с аминокислотами, на среде с 10 % лактозы. Характерной особенностью энтерогеморрагических кишечных палочек E. coli О157:Н7, в отличие от других E. coli, является отсутствие способности продуцировать ß-D-глюкуронидазу (95% штаммов) и расщеплять сорбитол. По другим биохимическим свойствам штамм E. coli О157:Н7 практически не отличается от E. coli (табл. 8).

Таблица 8

Основные биохимические свойства E. coli

Тест или субстрат	Наименование штаммов
E. coli	E. coli О157: Н7
Сорбитол	+	-
ß-D-глюкуронидаза	+	-
Цитрат Симонса	-	-
Мочевина	-	-
Малонат натрия	-	-
Сероводород	-	-
Фенилаланиндезаминаза	-	-
Ацетат натрия	+	+
Рамноза	±	±
Глюкоза (газ)	+	+
Лактоза	±	+
Сахароза	±	±
Арабиноза	+	+
Маннит	+	+
Адонит	-	-
Инозит	-	-
Дульцит	±	(±)
Салицин	±	(±)
Рафиноза	±	±
Ксилоза	±	+
ß-D-галактозидаза	+	+
Орнитиндекарбоксилаза	±	+
Лизиндекарбоксилаза	+	+
Аргининдегидролаза	±	-
Индол	+	+
Реакция с метиловым красным	+	+
Реакция Фогеса-Проскауэра	-	-

Примечание: + положительный ответ

- отрицательный ответ

± признак непостоянный

(±) – признак непостоянный, реакция замедленная

 

Кроме изучения биохимической активности, проводят определение подвижности, антигенной структуры бактерий и вирулентности выделенной культуры.

Токсигенность E. coli изучают на клетках почек мышей линии Y-1 или методом иммунопреципитации, инвазивность - на культурах клеток Hep-2, адгезивные свойства - на культурах клеток Hep-2, HeLa. Для обнаружения патогенных E. coli используются метод ДНК-ДНК гибридизации и полимеразная цепная редакция.

При выделении E. coli О157 или E. coli О157:Н7 определяют способность их продуцировать веротоксины (VT-1, VT-2). Для выявления веротоксинов предложен ряд методов: реакция пассивной латексной агглютинации, иммуноферментный анализ, биологическая проба на белых мышах, цитопатическая активность в отношении культуры клеток HeLa или почечных клеток Vero, полимеразная цепная реакция.

Шигеллезы

Бактерии рода Shigella являются возбудителями дизентерии, или шигеллеза, поражающей, главным образом, толстый кишечник. Дизентерия характеризуется общей интоксикацией организма и «кровавым поносом».

Дизентерия - полиэтиологическое заболевание. Род Shigella включает четыре вида: S. dysenteriae (серогруппа А), S. flexneri (серогруппа В), S. boydii (серогруппа С), S. sonnei (серогруппа D). Три первых вида подразделены на серовары, а S. flexneri - еще и на подсеровары.

Морфология и физиология. По морфологическим свойствам шигеллы мало отличаются от эшерихий, неподвижны, клетки некоторых штаммов имеют пили. Возбудителя дизентерии - хемоорганотрофы, не требовательны к питательным средам. Температурный оптимум – 37 °С. При выделении из организма больных микроб на плотных средах формирует, как правило, S-формы колоний. Шигеллы вида S. sonnei образуют два типа колоний: мелкие круглые выпуклые - S-формы (I фаза) и крупные плоские - R-формы (II фаза). Характер колоний зависит от наличия (I фаза) или отсутствия (II фаза) плазмиды м.м. 120 мДа, которая определяет также вирулентность шигелл Зонне. Бактерии I фазы при пересевах образуют колонии обоих типов. Шигеллы разлагают углеводы с образованием кислоты, в некоторых случаях - кислоты и газа, но не ферментируют лактозу (за исключением S. sonnei). Не образуют лизиндекарбоксилазу и аргининдигидролазу. Дифференциальные признаки рода Shigella представлены в таблице 9.

Таблица 9.

Основные биохимические свойства бактерий рода Shigella

Ферментация	глюкозы (газ)	-
лактозы	-
сахарозы	-
маннита	±
дульцита	±
салицина	-
адонита	-
инозита	-
Образование индола	±
Образование сероводорода	-
Реакция с метиловым красным	+
Реакция Фогеса-Проскауэра	-
Дезаминирование фенилаланина	-
Гидролиз мочевины	-
Гидролиз желатина	-
Рост на среде с KCN	-
Утилизация цитрата аммония	-
Утилизация малоната Nа	-

Примечание: + положительный ответ; - негативный ответ

± признак непостоянный

Антигены. Шигеллы имеют сложную антигенную структуру. В составе их клеточных стенок имеется О-, а у бактерий некоторых видов (S. flexneri) и К-антигены. О-антигены различаются по специфичности: общие для семейства Enterobacteriaceae, родовые, видовые, групповые, типоспецифические. В классификации учитываются только групповые и типоспецифические О-ан-тигены. В соответствии с этим род Shigella подразделяется на 4 подгруппы и включает 44 серотипа.

В подгруппу А (вид S. dysenteriae) включены шигеллы, не ферментирующие маннит. Вид включает 12 серотипов (1-12).

К подгруппе В (вид S. flexneri) относятся шигеллы, обычно ферментирующие маннит, содержащие типоспецифические антигены (I-VI), по которым подразделяются на серотипы (1-6). Кроме того, они содержат групповые антигены, по которым серотипы подразделяются на подсеротипы. Этот вид включает два антигенных варианта - X и Y. Серотип S. flexneri 6 не имеет подсеротипов, но его разделяют на 3 биохимических типа по особенности ферментации глюкозы, маннита и дульцита (биотипы Бойд 88, Манчестер, Ньюкасл).

К подгруппе С (вид S. boydii) относятся шигеллы, обычно ферментирующие маннит. Вид включает 18 серотипов (1-18), каждый из которых имеет свой главный типовой антиген.

В подгруппу Д (вид S. sonnei) входят шигеллы, обычно ферментирующие маннит и способные медленно (через 24 ч и позже) разлагать лактозу и сахарозу. Вид S. sonnei включает один серотип, однако колонии I и II фаз обладают своими типоспецифическими антигенами. Для внутривидовой классификации шигелл Зонне предложено два метода: а) деление их на 14 биохимических типов и подтипов по способности ферментировать мальтозу, рамнозу и ксилозу; б) деление на фаготипы по чувствительности к набору соответствующих фагов.

Эти способы типирования имеют, главным образом, эпидемиологическое значение.