Исследование клинического материала.

На I этапе бактериологического анализа испражнений и рвотных масс больного, содержимого кишечника и желчного пузыря трупа лиц, умерших от холеры, исследуемый материал в количестве 0,5-1 мл засевают пипеткой в 50-100 мл 1% ПВ (I-ая среда накопления) и петлей на пластинку щелочного агара и одну из элективных сред. Целесообразно на этом этапе применить ускоренные методы исследования (МФА, РИВ и ПЦР со специфическими праймерами).

При исследовании материала от больных, подозрительных на заболевание холерой, не допускается в качестве накопительной среды использование 1% пептонной воды с теллуритом калия.

Материал от подозрительных на вибриононосительство засевают в 50 мл среды накопления при индивидуальных анализах и в 100 мл – при групповых, объединяя в один флакон по 0,5-1 мл пробы не более чем от 5 человек. К групповым посевам прибегают в редких случаях при проведении массовых обследований на вибриононосительство.

Материал, доставленный в 5 мл 1% пептонной воды, полностью используется для посева в 50 мл среды накопления. В случае поступления в лабораторию материала, забранного в 50 мл 1% пептонной воды во флаконе и доставки его не позже 2 ч после забора пробы, флакон помещают в термостат на 6 ч для накопления возбудителя. При доставке материала в более поздние сроки 5 мл его засевают в 50 мл 1% пептонной воды.

В отдельных случаях при бактериологическом исследовании материала от лиц, принимавших антибиотики, его засевают в 200-300 мл 1% пептонной воды (предпочтительно в широкодонные колбы) и на 2 чашки щелочного агара так, чтобы получить рост в виде изолированных колоний. Посевы инкубируют при 37 °С в течение 24 ч и спустя 8-10 ч инкубации делают последовательные высевы с поверхностного слоя среды на пластинки щелочного агара. Использование второй среды обогащения в этом варианте исследования не целесообразно.

На II этапе (через 6-8 ч от начала исследования) с поверхности I-ой среды накопления производят пересев на пластинку щелочного агара, на одну из элективных сред, и в 5-8 мл 1% ПВ (II-ая среда накопления). Пересевы в жидкие и на плотные среды делают с поверхности жидкой среды большой бактериологической петлей диаметром 5 мм.

При отрицательных результатах ускоренных методов исследования нативного материала их повторяют, исследуя I-ую среду накопления.

На III этапе (через 12-16 ч от начала исследования) высевают с поверхности II-ой среды накопления на пластину щелочного агара.

В случае необходимости ускорения хода анализа материала от больного, подозрительного на заболевание холерой, отбор колоний со щелочного агара, засеянного в начале исследования, можно начинать уже на этом этапе, в остальных случаях - на следующем.

На IV этапе (через 18-24 ч от начала исследования) производят отбор подозрительных на холерный вибрион колоний в посевах на плотные среды нативного материала, а также в высевах из 1 и 2 накопительных сред. При отборе колоний обращают внимание, как на типичные, так и на атипичные колонии. На щелочном агаре колонии холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп в типичной S-форме – круглые, гладкие, плоские, голубоватые, гомогенные с ровными краями, прозрачные в проходящем свете, светло-голубые под стереоскопическим микроскопом в косопроходящем свете с голубым или зеленоватым оттенком.

Колонии холерных вибрионов на элективных средах TCBS и СЭДХ имеют ярко-желтую окраску на зеленом или синем фоне среды, полупрозрачные; на среде Монсура – матовые, серовато-белого цвета с черным центром (окраска центра наиболее выражена через 24 - 48 ч).

Атипичные колонии холерных вибрионов: мутные с плотным центром, пигментированные (коричневые или светло-желтые), шероховатые или мелкие коккоподобные.

Отобранные по оксидазной пробе агглютинирующиеся и неагглютинирующиеся холерными сыворотками О1 или О139 колонии отсевают для последующей идентификации на одну из полиуглеводных сред (лактозо-сахарозную, Клиглера, универсальный скошенный столбик, Ресселя и др.), на косячок МПА и пробирку МПБ для выделения чистой культуры, её идентификации и определения чувствительности к антибиотикам.

При положительной реакции агглютинации с холерной О1 сывороткой в разведении 1:50 и 1:100 и достаточном количестве подозрительных колоний ставят слайд-агглютинацию с варианто-специфическими сыворотками Инаба и Огава в том же разведении, реакцию иммобилизации, приготовляют мазки для окраски по Граму и обработки флюоресцирующими иммуноглобулинами. При положительных результатах выдают предварительный ответ об обнаружении в исследуемом материале холерного вибриона О1, а в случае положительной реакции с сывороткой О139 – холерного вибриона О139 серогруппы.

V этап (через 24-36 ч от начала исследования). Просматривают полиуглеводные среды и отбирают культуры с типичным для вибрионов характером роста и изменений среды. На двухуглеводных средах наблюдается характерное для кислой реакции изменение цвета столбика при сохранении цвета скошенной части без образования газа, а также сероводорода, улавливаемого в среде Клиглера. Культуры, выросшие на щелочном агаре, проверяют на наличие индофенолоксидазы.

Определяют морфологию микроорганизмов и чистоту отобранных культур на щелочном агаре и полиуглеводных средах в мазках, окрашенных по Граму. Подозрительные культуры проверяют в ориентировочной реакции агглютинации с холерными сыворотками О1 в разведении 1:100, РО, Инаба, Огава в разведении 1:50. При отрицательных результатах с этими сыворотками ставят слайд-агглютинацию с холерной сывороткой О139 серогруппы, используя её в соответствии с инструкцией по применению.

На основании положительных результатов агглютинации с холерными сыворотками О1, Инаба и/или Огава выдают предварительный положительный ответ о выделении из исследуемого материала культуры холерного вибриона О1 соответствующего серовара. Если выделенная культура реагирует с холерной сывороткой О139 при отрицательных результатах с сыворотками О1 серогруппы выдают ответ о выделении холерного вибриона О139 серогруппы.

Проводят идентификацию выделенных оксидазопозитивных агглютинирующихся или не агглютинирующихся культур по сокращенной или полной схеме.

VI этап (через 36-48 ч от начала исследования). Учитывают результаты идентификации и выдают окончательный ответ о выделении культуры холерного вибриона соответствующей серогруппы и биовара. Для холерных вибрионов О1 (Инаба, Огава или Гикошима) указывают эпидемическую значимость ориентировочно по тестам гемолитической активности, чувствительности к фагам ctx⁺ и ctx^- и окончательно – по результатам молекулярного зондирования или ПЦР на присутствие в геноме выделенной культуры ctx AB гена, а также токсигенности на модели кроликов-сосунков. Эпидемическую значимость холерных вибрионов 0139 серогруппы определяют по тем же тестам, кроме чувствительности к фагам ctx⁺ и ctx^-. К окончанию этого этапа исследования должна быть определена антибиотикограмма выделенной культуры.

При выделении от больного или вибриононосителя культуры холерного вибриона, не агглютинирующейся холерными сыворотками (О1 и О139), выдают ответ о выделении холерных вибрионов не О1 и не О139 серогрупп. При наличии вибрионных агглютинирующих диагностических сывороток определяют принадлежность к другим серогруппам (О2-О83).