Двойная радиальная иммунодиффузия по Оухтерлони

В слое агарового геля равномерной толщины на определенном расстоянии друг от друга вырезают лунки для АГ и антисыворотки и заполняют их соответствующими растворами. АГ и АТ диффундируют в гель, соединяются друг с другом и образуют иммунные комплексы, которые преципитируют в гранулах геля, становясь видимыми как линии преципитации. Двойную радиальную иммунодиффузию применяют главным образом для качественного анализа, например для определения числа АГ в различных жидкостях (в сыворотке крови, цереброспинальной жидкости), для оценки чистоты препаратов при выделении АГ, для сравнения известных АГ и АТ с неизвестными, а также с целью наблюдения за ходом иммунизации животных.

Готовят последовательные двукратные разведения антисыворотки и равные объемы каждого из них вносят в лунки, расположенные по периферии. Центральную лунку заполняют раствором АГ. При оценке результатов иммунодиффузии учитывают: расстояние, отделяющее линию преципитации от центральной и периферической лунок; интенсивность и ширину полос преципитации; последнее разведение антисыворотки, при котором еще можно видеть преципитат.

Оценка результатов: При оптимальном соотношении между АГ и АТ линия преципитации располагается почти посередине между лунками. Количественное преобладание одного из реагентов сдвигает линию преципитации к лунке другого реагента. АГ и АТ образуют видимые преципитаты при концентрациях белка от 5 до 50 мкг/мл.

Сравнительный анализ. Для сравнения АГ обычно в геле вырезают три лунки, расположенные треугольником. В две из них помещают сравниваемые растворы АГ, а в третью - антисыворотку. Принципиально возможны три варианта расположения линий преципитации:

1. Обе линии полностью сливаются. Это говорит об идентичности антигенов в обеих лунках.

2. Одна из линий длиннее другой и, выходя из последней, образует так называемую шпору. Шпора часто бывает тоньше, чем основные линии преципитации. Вторая линия сливается с линией, образовавшей шпору. В данном случае это свидетельствует о частичной идентичности антигенов. Оба АГ имеют некоторые общие детерминанты, которые, соединяясь с АТ, дают сливающиеся линии преципитации. Однако у первого АГ имеются еще и детерминанты, которых нет у второго.

3. Линии пересекаются, либо не сливаются и не пересекаются. Это указывает на неидентичность антигенных детерминант и, следовательно, на различие молекул исследуемых АГ.

Простая радиальная иммунодиффузия по Манчини: используют в основном для количественного определения АГ. Чаще всего исследуют белковыеАГ: белки сыворотки крови, цереброспинальной жидкости, секретов желез, экстрактов из органов и т.д. Метод получил широкое распространение в клинических биохимических лабораториях. На ровную поверхность равномерным слоем наносят гель, содержащий АТ. В геле вырезают лунки и заполняют их раствором АГ. Молекулы АГ радиально диффундируют из лунки и, встретившись с АТ, образуют кольцо преципитации. До тех пор пока в лунке сохраняется избыток АГ, диаметр кольца преципитации постепенно увеличивается. Оценку результатов проводят путем измерения колец преципитации на влажных и окрашенных препаратахс помощью окулярного микрометра, который прикладывают к обратной стороне стекла.

Сушка и хранение препаратов: для длительного хранения препараты высушивают. До этого их отмывают от непрореагировавших компонентов в физиологическом растворе, инкубируя 2 -3 сут при 3 - 5 его сменах. Окрашивание препаратов: препараты окрашивают красителями, выявляющими белок. Чаще всего применяют амидо-черный, кумасси ярко голубой, бромфеноловый синий и др. Для этого стекла с отмытым и высушенным гелем помещают на 1 - 5 мин в краситель и держат до тех пор, пока окрашенный преципитат не будет отчетливо виден на фоне окружающего геля. В качестве обесцвечивающего раствора используют растворитель самой краски.

Иммуноэлектрофорез (ИЭФ). Принцип ИЭФ - вначале проводят электрофоретическое разделение смеси белков в забуференном агаровом геле. Затем в канавку, которая идет в направлении миграции белков, вносят преципитирующую иммунную сыворотку. АГ и антисыворотка диффундируют в геле навстречу друг другу, и в месте их взаимодействия возникают дуги (линии) преципитации. Число, положение и форма этих линий дают представление о составе исходной смеси антигенов. ИЭФ - один из широко распространенных методов качественного анализа АГ. В клинике ИЭ чаще всего используют при диагностике иммунодефицитных состояний. Он незаменим как метод последовательного наблюдения за процессом очистки белковых препаратов.

Приготовление гелей: гель готовят так же, как для иммунодиффузии, за исключением того, что вместо ФР используют подходящий буферный раствор, чаще всего - барбиталовый или боратный буфер рН от 6,0 – 9,0.

Ракетный иммуноэлектрофорез: гель агарозы смешивают с моноспецифической антисывороткой и равномерным слоем распределяют по поверхности стекла. В полученном геле вырезают лунки и заполняют их исследуемым АГ. В электрическом поле молекулы АГ мигрируют в гель и взаимодействуют с АТ. По мере продвижения молекулы АГ постепенно связываются АТ, образуя вытянутый в длину остроконечный преципитат. В стандартных условиях (концентрация геля, толщина его слоя, содержание в нем антисыворотки, напряжение и сила тока) длина такого преципитата прямо пропорциональна концентрации АГ. Впервые был предложен К. Лореллом в 1966 г., обычно используется для количественного определения белка в жидкостях организма. Его существенным преимуществом по сравнению с иммунодиффузией по Манчини является быстрота получения результатов.

Перекрестный иммуноэлектрофорез: на первом этапе проводят электрофоретическое разделение смеси белков (например, сыворотки) в геле агарозы. Затем разделенные белки вновь подвергают электрофорезу в направлении, перпендикулярном первому этапу. При этом гель содержит АТ, образующие с исследуемыми белками преципитаты в форме пиков. Высота или площадь этих пиков прямо пропорциональна концентрации соответствующих АГ в исследуемой смеси. Площадь пиков зависит также от концентрации антител в геле.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ЗАНЯТИЯ

Преципитационные методы

Основные рекомендации при постановке реакции иммунодиффузии в геле (РИД):

Приготовление гелей: чаще всего в качестве гелеобразующих агентов применяют агар или агарозу. Разнообразные фирменные типы агаров сильно различаются по степени чистоты. Некоторые марки агаров могут быть использованы без очистки, такие, как Difco Bacto Agar, Difco Special Agar, Oxoid Ion Agar, Behringwerke Rein Agar, Litex, Pharmacia. Готовить агар желательно только для одного эксперимента или, в крайнем случае, для нескольких опытов, поскольку многократное разогревание перед каждым опытом приводит к испарению жидкости и изменению концентрации и, следовательно, физико-химических свойств агара. Отвешивают определенное количество агара, переносят его в колбочку и добавляют необходимый объем ФР или буфера. Колбочку со смесью ставят в кипящую водяную баню до полного растворения агара. Затем в раствор добавляют один из консервантов для предотвращения роста микроорганизмов: 0,01-0,05 %-й азид натрия (NaN₃), 0,1-0,12 %-й мертиолат натрия или 0,1 %-й фенол. Необходимо следить за тем, чтобы агар был не только стерильным, но и максимально прозрачным. Он не должен содержать посторонних механических примесей, особенно ворсинок от марли или ваты. Для улучшения формирования иммунопреципитатов иногда добавляют 2-4 %-й полиэтиленгликоль или декстраны. Подготовка стекол и заливка агара: иммунодиффузию проводят на стеклах, чаще всего предметных, или фотопластинках. Обезжиренные стекла желательно покрыть тонким слоем 1 %-го водного агара и высушить при комнатной температуре или при 70 °С. К таким стеклам хорошо прилегает гель. Для получения одинаковой толщины агара стекла помещают на строго горизонтальную поверхность. Залитые агаром стекла помещают во влажную камеру, например, в эксикатор, на дно которого наливают воду с антисептиком. Стекла можно поместить в эксикатор во влажной чашке Петри. Приготовление лунок: для просечения лунок в агаре применяют стандартные штампы, состоящие из трубок-пробойников. В зависимости от поставленной задачи используют штампы, содержащие 4, 5 или 7 трубок-пробойников. Наружные диаметры трубок могут варьировать от 3 до 5 мм. Для постановки иммунодиффузии по Манчини используют отдельные трубки-пробойники или инъекционные иглы со сточенным концом. В этом случае под стекло с агаром кладут трафарет и пробойником просекают контуры лунок. Агаровые пробки отсасывают с помощью вакуумного насоса. Температура: результаты иммунодиффузии существенно не зависят от температуры. Опыт может быть поставлен при 4, 20 или 37 °С. Удобнее всего работать при комнатной температуре. Следует лишь избегать резких колебаний температуры в ходе инкубации. Электролиты: в качестве электролитов используют 0,15 М NaCL либо фосфатный или барбиталовый буфер. Постановка опыта: для того чтобы избежать подсыхания агара, опыт на одном стекле должен быть поставлен в максимально короткие сроки (10-15 мин). В лунки в зависимости от их диаметра вмещается от 2 до 40 мкл раствора реагента. При заполнении лунок доверху жидкость не должна переливаться через край. Сразу же после заполнения лунок реагентами стекло помещают в эксикатор. Иммунодиффузия может продолжаться от 2 до 7 сут в зависимости от задачи.