Микробиологическая диагностика сибирской язвы

Основным источником инфекции являются больные травоядные животные, от которых человек заражается при непосредственном контакте, алиментарным, аэрогенным или трансмиссивным путями. Чаще всего возникает кожная форма инфекции с образованием характерного сибиреязвенного карбункула в виде уголька (anthrax), реже – кишечная, легочная, септическая формы. Методы микробиологической диагностики сибирской язвы отражены в схеме 6.

Схема 6. Микробиологическая диагностика сибирской язвы

	Материал: отделяемое карбункула или язвы, испражнения, моча, мокрота, кровь

 

Серологический метод Постановка РНГА, РА с целью определения антител в крови больного

 

	Аллергодиагностика Постановка внутрикожной аллергической пробы с тулярином. Учет через 24-48 часов.

	Выявление сибиреязвенного антигена Постановка реакции термопреципитации Асколи с преципитирующей противосибириязвенной сывороткой
		Генодиагностика. ПЦР

Микроскопический метод. Мазки из исследуемого материала окрашивают по Граму, Романовскому-Гимзе, Ребитеру (капсула), а также люминесцирующей сибиреязвенной сывороткой. Обнаружение в препаратах окруженных капсулой крупных грамположительных ба­цилл в виде цепочек дает возмож­ность поставить предварительный диагноз сибирской язвы (рис.11 а). В качестве экспресс-метода диагностики применяется РИФ, с помощью которой выявляют характерные сибиреязвенные бациллы в виде палочек со светящимся жел­то-зеленым ободком (рис. 11 б.).

Бактериологический метод -посев исследуемого материала на МПА, кровяной агар в чашках Петри или PLET-arap с полимиксином В, лизоцимом, этилен-диаминотетраацетатом (ЭДТА) и ацетатом таллия. Контаминированный мате­риал из внешней среды, от животных, из старых трупов предварительно прогревают при 63 °С в течение 15 мин с целью уничтожения вегетативных форм микроорга­низмов. Посевы помещают в термостат на сутки. Через 20 —24 ч инкубации посевов при 37⁰ С на МПА обнаруживают характерные шероховатые колонии в виде «головы меду­зы», края которых при малом увеличении микроскопа имеют вид вьющихся локонов или «львиной гривы» - рис. 12. В бульоне характерен при­донный рост, напоминающий комочек ваты, при этом среда остается про­зрачной. Из осадка делают мазок и препарат висячей капли. В мазке обнаруживают бескапсульные грамположительные стрептобациллы (рас­положение в виде длинных цепочек в виде «бамбуковой палки»). В отличие от других почвенных бацилл возбудитель сибирской язвы неподвижен. Для выде­ления чистой культуры типичные колонии пересевают на ско­шенный МПА.

Капсулообразование можно выявить путем биопробы или при посевах в бульон Хоттингера, на специальную среду, содержащую раствор Хенкса и 40 % стерильной сыворотки крупного рогатого скота, МПА с 0,7 % бикарбоната натрия, среду Буза (3%голодный агар с 15% дефибринированной крови барана), а также в дефибринированную лошадиную кровь. Посевы выращивают в течение 18-24 часов при температуре 37⁰ С в атмосфере 5-7% СО_2.

А б

 

Рис. 11. Возбудитель сибирской язвы(Bacillus anthracis). а - окраска по Граму, б – РИФ. х630

Рис. 12. Колония Bacillus anthracis. х56

 

Идентификацию выделен­ной культуры Bacillus anthracis (3-й день исследования) и ее дифференциацию от сходных непатогенных бацилл проводят путем посева уколом в желатину (разжижение в виде елочки, перевернутой вершиной вниз), изучения биохимических свойств, фаголизабельности и заражения животных. Определяют также чувствительность культуры к ан­тибиотикам.

Одним из характерных признаков возбудителя сибирской язвы является тест «жемчужного ожерелья».На поверхность МПА в чашке Петри с 0,5 и 0,05 ЕД/мл пенициллина засевают 3-ча­совую бульонную культуру выделенного микроорганизма, через 3 ч инкубирования при 37⁰ С готовят мазки, в которых при микроскопии находят «жемчужные ожерелья» в виде округлившихся стрептобацилл сибирской язвы. Почвенные ба­циллы сохраняют форму палочек, расположенных цепочками.

Биологические свойства возбудителя сибирской язвы и сходных с ним бацилл отражены в табл. 7.

Наличие сибиреязвенного антигенав разложившемся трупе жи­вотного, коже (свежей, сухой, выделанной) и изделиях из нее, шкурках, мехе, шерсти определяют с помощью реакциитермо­преципитациипо Асколи.Исследуемый материал измельчают, за­ливают 10 —20-кратным объемом физиологического раствора, кипятят в течение 10-45 мин., после чего фильтруют. Полученный экстракт осторожно наслаивают на преципитирующую сибиреязвенную сыворотку в узкой преципитационной пробирке. На границе экстракта и преципитирующей сыворотки в течение 1- 5 мин в случае положительной реакции появляется кольцо белого цвета (преципитат). Контроли включают постановку реакций с заведомо положительной и отрицательной сывороткой, нормальной сывороткой и т.д.

Биопроба. Исследуемымматериалом подкожно заражают двух белых мышей., которые погибают через 24-48 ч после заражения. В мазках из внутренних органов и крови обнаружива­ют типичные капсульные бациллы. Проводится бактериологическое исследование трупа белой мыши с целью выделения чистой культуры сибиреязвенных бацилл.

Таблица 7. Дифференциально-диагностические признаки сибиреязвенной и других бацилл

 

Признак	Вид микроорганизмов
	Bacillus anthracis	Bacillus cereus	Bacillus mycoides	Bacillus thuringiensis	Bacillus subtilis	Bacillus Megaterium
Капсула	+	-	-	-	-	-
Подвижность	-	+	-	+	+	+
Гемолиз	-	+	-	+	-	+
Рост в анаэробных условиях	+	+	+	+	-	-
Лецитиназа	+	+	+	+	-	-
Аргининдегидролаза	-	V	V	+	-	-
Нитpaтpeдyктaзa	+	+	+	+	+	-
Патогенность для мышей	+	-	-	-	-	-
Ферментация до кислоты:
глицерина	-	V	+	+	+	+
маннита	-	-	-	-	+	+
салицина	-	V	+	+	+	+

 

Обозначения: «-«- отрицательная; «+» - положительная; «V» - вариабельная реакции.

 

Серологический метод выполняетсяв тех случаях, когда не удается обнаружить возбудителя в материале. Для определения антител в сыворотке крови больного использу­ют реакции латекс-агглютинации и РНГА с протективным сибиреязвенным антигеном.

Аллергический метод – постановка внутрикожной аллергической пробы с аллергеном сибиреязвенной бациллы - антраксином. Результаты учитывают через 24 ч. Пробу считают положительной при наличии гиперемии и инфильтрата диаметром более 15 мм.

Самостоятельная работа студентов

1. Микроскопия демонстрационных микропрепаратов возбудителя сибирской язвы (Bacillus anthracis, окраска по Граму). Бациллы сибирской язвы - крупные спорообразующие, капсульные грамположительные палочки, располагающиеся цепочками, напоминая бамбуковую палку.

2. Бактериологический метод. Изучить характер роста на МПА и МПБ культуры B.cereus, имитирующей рост Bacillus anthracis. На жидкой питательной среде (бульон Хоттингера) рост бацилл напоминает комочек ваты, на плотной питательной среде (МПА, сывороточный МПА длявыявления капсулообразования) - «гриву льва», или «голову медузы». Сибиреязвенная палочка разжижает желатин в виде елоч­ки верхушкой вверх. Под действием пенициллина сибиреязвен­ные палочки образуют сферопласты в виде жемчужин, что используется для дифференциации Bacillus anthracis от непатогенных бацилл. Отразить в рабочей тетради биологические свойства Bacillus anthracis и сходных с ней бацилл, пользуясь таблицей7.

Для оценки загрязненности сырья (шерсть, шкуры животных) возбудителем сибирской язвы используется реакция кольцепреципатации по Асколи. Поставить реакцию по Асколи. Ингредиенты: преципитирующая сибиреязвенная сыворотка, термостабильный антиген из исследуемого материала, физио­логический раствор. Схема постановки реакции Асколи: в препиптационную пробирку наливают 0,5 мл преципитирующей сыворотки, пастеровской пипеткой сверху осторожно наслаивают антиген. В положительном случае на границе сыворотки и антигена появляется преципитат в виде кольца. В контрольную пробирку вместо антигена вносят физиологический раствор.

3. Серологическая диагностика сибирской язвы. Учесть реакцию непрямой гемагглютинации с сывороткой крови больного и эритроцитарным сибиреязвенным диагностикумом.

4. Аллергический метод диагностики сибирской язвы. Для постановки кожной аллергической пробы у больных сибирской язвой используется сибиреязвенный аллерген - антраксин (белково-полисахаридно-нуклеиновый комплекс, полученный при гидролизебацилл сибирской язвы).

5. Специфическая профилактика сибирской язвы: живая вакцина СТИ (высушенная взвесь живых спор вакцинного штамма - вариан­та сибиреязвенных бацилл, названа в честь Санитарно-технического института, в котором она была разработана).

6. Специфическое лечение сибирской язвы: противосибиреязвенныйиммуноглобулин (гамма-глобулиновая фракция сыворотки крови лошадей, гипериммунизированных живой вакциной и вирулент­ным штаммом В.anthracis).

После изучения темы студент должен знать: таксономию, морфологические и биологические свойства возбудителей основных бактериальных зоонозных инфекций (чумы, туляремии, сибирской язвы), а также патогенез, эпидемиологию, основные клинические проявления и иммунитет; основные методы диагностики, специфической профилактики и лечения этих инфекций.

Изучив тему, студент должен уметь: уметь ставить серологические реакции при туляремии, трактовать результаты микробиологических анализов при чуме,туляремии, сибирской язве.

Педиатрические аспекты темы

1. Дети в возрасте от 1 до 2 лет прививаются противочумной вакциной только при неблагоприятной эпидемической ситуации, при этом дети до 7 лет прививаются накожно, а с 7 лет - накожно и подкожно.

2. В неблагополучной по туляремии местности прививкам живой вакциной подвергают все население с 7-летнего возраста. По эпидемическим показаниям вакцинируют детей старше 2 лет.

Тема 4. ВОЗБУДИТЕЛИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЗООНОЗНЫХ ИНФЕКЦИЙ: БРУЦЕЛЛЕЗА, ЛЕПТОСПИРОЗА, БОРРЕЛИОЗОВ, ЛИСТЕРИОЗА

Цель занятия: изучение биологических свойств возбудителей бактериальных зоонозных инфекций - бруцеллеза, лептоспироза, клещевого боррелиоза, листериоза и методов их лабораторной диагностики, профилактики и лечения.