Микробиологическая диагностика иерсиниозов

Энтеропатогенные иерсинии (Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis) вызывают кишечные инфекции, характеризующиеся поражением лимфоидного аппарата кишеч­ника, токсико-аллергическими осложнениями, развитием генерализованных процессов.

Микробиологическая диагностика иерсиниозов включает бактериологическое и серологическое исследования.

Бактериологическое исследование. Материал, подлежащий исследованию (фекалии, кишечные биоптаты, лимфоузлы или ткань удаленного аппендикса, кровь, слизь из ротоглотки), об­рабатывают в течение 1 минуты 0,5% раствором гидроксида ка­лия в 0,5% хлориде натрия, затем делают посевы на агар CIN, Серова или среду Эндо, которые после посева инкубируют при 32 °С в течение 24—48 ч или 24 ч при 37⁰ С и столько же при комнатной температуре. Параллельно посевы помещают в холодильник при температуре +4⁰ С (иерсинии хорошо растут при низ­ких температурах). Пересевы со среды накоп­ления выполняют на 3, 5, 10, 15-е сутки на указанные выше питательные среды.

На 2-й (3-й) день изучают первичные посевы. Энтеропатогенные иерсинии образуют более мелкие колонии, чем прочие энтеробактерии, на среде CIN колонии имеют красный центр и бесцветную периферию («бычий глаз»), на среде Эндо колонии бесцветные или с более интенсивно окрашенным центром. У Y. enterocolitica иу Y. pseudotuberculosis часто наблюдается диссоциация колоний с переходом в R (шероховатые) формы. Характерные для иерсиний ко­лонии пересевают для накопления чистой культуры на скошенный МПА или на среду Ресселя или Олькеницкого.

На 3-й (4-й) день проводят идентификацию чистой культуры по биохимическим и антигенным свойствам (биовар, серогруппа с помощью РА у культур, выращенных при температуре ниже 30⁰ С), учитывают тем­пературу физиологического оптимума иерсиний (28-30⁰ С), определяют чувствительность к анти­биотикам. Воз­будители иерсиниоза и псевдотуберкулеза оксидазоотрицательны, ферментируют до кислоты глю­козу, обладают нитратредуктазой и другими свойствами (см. табл. 5).

В отличие от возбудителя псевдотуберкулеза, бактерии вида Y. enterocolitica по биологическим свойствамгетерогенны, включая безусловно-патогенные, условно-патогенные (возбудители оппортунистической инфекции или пищевого отравления) и непатогенные для человека иерсинии. Определение факторов виру­лентности у Y. enterocolitica предполагает постановку реакций аутоагглютинации и кальцийзависимости, пиразинамидазного теста, определение плазмидассоциированных антигенов.

Тест аутоагглютинации. В две пробирки со средой Кларка за­севают исследуемый штамм, инкубируют в течение 24 ч одну пробирку при 37⁰ С, другую - при 26 - 28⁰ С. При наличии вирулентности бактерии, выращенные при температуре 37⁰ С, склеиваются в виде хлопьев, оседающих на дно и стенки пробирки. Культура, инкубированная при температуре 26 – 28⁰ С, не агглютинируется.

Определение пиразинамидазной активности. На скошенную среду с пиразинамидом, засевают исследуемые культуры, выращенные при температуре 25-30⁰ С на ПА, инкубируют при той же температуре в течение 48 часов, после чего смачивают скошенную поверхность раствором суль­фата аммонийного железа, оставляя пробирку при комнатной температуре в течение 15 мин. В пробирках с культурами патогенных иер­синий цвет среды остаются без изме­нений; непатогенные иерсинии меняют цвет скошенной части среды на коричневый.

Тест кальцийзависимости ставят на кальций-дефицитном агаре, который готовят путем добавления раствора оксалата натрия к расплавленному МПА. После перемешивания вносят 4 мл 0,5М раствора хлорида магния. Исследуемую культуру засевают на 2 чашки с кальций-дефицитным агаром, одну чашку инкубируют 24 — 48 часов при 37⁰ С, другую - при 26 - 28⁰ С. При наличии вирулентности при дефиците кальция у клеток, инкубированных при 37 °С (но не 26 – 28⁰ С), прекращается рост бактерий, при этом колонии на чашке либо имеют карликовые размеры (Y. enterocolitica ), либо отсутствуют совсем (чаще у Y. pseudotuberculosis ). При 26 – 28⁰ С так же, как у непатогенных иерсинии при двух температурных режимах, на­блюдается рост колоний обычных размеров.

Серологическое исследование заключается в постановке РА, РНГА или ИФА с иерсиниозными диагностикумами и парными сыворотками крови больных с подозрением на иерсиниоз с целью определения специфических антител.

Генодиагностика – обнаружение типичных фрагментов ДНК патогенных иерсиний в клиническом материале или пищевых продуктах мето­дами ДНК-ДНК-гибридизация или ПЦР-анализа.

Самостоятельная работа студентов

1. Бактериологический метод. Изучение культуральных (на среде Эндо и скошенном МПА) и биологических (тесты аутоагглютинации и кальцийзависимости, определение пиразинамидазной активности) свойств Y.enterocolitica (демонстрация).

2. Серологический метод учет РНГА, поставленной с иерсиниозным эритроцитарным диагностикумом и сыворотками кро­ви больного, взятыми на 3 и 10 дни заболевания (демонст­рация).

3. Серологический метод учет ИФА, поставленной с сыворотками кро­ви больного, взятыми на 3 и 10 дни заболевания (демонст­рация).