Обнаружение специфических антител

По свойствам антител различают два понятия: аффинность (или аффинитет) и авидность (или авидитет).

Аффинность — это степень специфического сродства активного центра к антигенной детерминанте; авидность — это степень проч­ности связывания молекулы антитела с молекулой антигена. Чем выше аффинность (степень сродства), тем выраженнее и авидитет (прочность связывания). Кроме того, авидитет тем сильнее, чем больше связывающихся центров.

Антитела, реагирующие на инфекцию, впервые появляются примерно через неделю после заражения. Вначале вырабатывают­ся антитела класса IgM, затем начинают вырабатываться антитела класса IgG. После появления антител класса IgG начинается сни­жение титров IgM-антител. Через некоторый промежуток време­ни, длительность которого зависит от особенностей возбудителя и организма больного, антитела IgM уже не определяются. Нараста­ние уровня IgG происходит в течение нескольких недель. IgG обла­дают наиболее высокими аффинностью и авидностью. В начале иммунного ответа образуются низкоаффинные антитела. Позже в процессе вырабатывания иммунного ответа в организме появляют­ся высокоаффинные IgG-антитела. Высокоаффинные IgG-антитела остаются в организме в течение длительного времени.

В случаях, когда IgM обнаруживаются в крови, необходимо раз­делять первичную инфекцию и обострение. Для этого рекомендует­ся определять авидность антител IgG. Если в крови при наличии IgM обнаруживаются IgG с низкой авидностью, то это свидетельст­вует о первичной инфекции. Наличие же высоко авидных антител IgG (в присутствии IgM) говорит о вторичном иммунном ответе в случае попадания возбудителя в организм или обострения (реакти­вации) инфекции.

У новорожденных выявление IgM-антител имеет диагностиче­ское значение, так как материнские IgM, в отличие от IgG, не проникают через плаценту. Появление IgM у новорожденных на­блюдается только при их инфицировании, в то время как обнару­жение IgG может быть следствием пассивного переноса от матери.

--------------------------------------- Глава 3 -------------------------------------------

Материнские антитела могут персистировать у ребенка до одного года. Поэтому целесообразно одновременно исследовать сыворот­ку матери и младенца, что позволяет исключить пассивный пере­нос антител.

Антитела определяют с помощью серологических реакций, принцип которых заключается в выявлении антител с помощью специфического антигена. Реакция основана на специфическом связывании антиген—антитело.

Для выявления антител используют классические серологичес­кие способы (РСК, РПГА, РН, РИФ), а также ИФА, чувствитель­ность которого на 2-4 порядка выше по сравнению с классическими серологическими методами.

Важными понятиями в серодиагностике являются: сероконвер-сия антител, титр антител, серая зона.

Сероконверсия — появление специфических антител в сыворот­ке крови или увеличение их титра в 2-4 раза.

Титр антител — способ полуколичественного выражения со­держания специфических антител в сыворотке крови. Титр выра­жается в виде дроби, представляющей собой степень разведения исследуемой сыворотки, при котором анализ дает результат (1: 100; 1:200 1:400 и т. д.). Более современные тест-системы позволяют оп­ределять количественное значение антител, которое выражается в Международных единицах (ME) или нанограммах на литр.

Серая зона — это диапазон концентраций специфических анти­тел, в который с равной вероятностью могут попадать как положи­тельные, так и отрицательные пробы. В этом случае для уточнения результата необходимо повторить исследование с новой сыворот­кой, полученной через 1-2 недели.

Хламидийная инфекция

Chlamydia trachomatis — внутриклеточный микроорганизм, тропный к цилиндрическим эпителиальным клеткам, поэтому по­лученные пробы должны содержать как можно больше эпители­альных клеток. Некачественно отобранный материал приводит к появлению ложноотрицательных результатов.

Материалом для исследования на Chlamydia trachomatis явля­ются мазки конъюктивы, шейки матки.

Традиционно «золотым стандартом» считают культуральный метод диагностики, предложенный в 1965 году J.B. Gordon и A.L. Quan. Это чувствительный и достоверный метод диагности­ки, который не дает ложноположительных результатов. Однако

______________________ Глава 3 -------------------------------------------------

данный метод трудоемкий, дорогой и требует наличия необходи­мого оборудования и используется в настоящее время в исследо­вательских целях.

Исторически первым было открытие телец Гельберта-Прова-чека в цитоплазме пораженных клеток конъюнктивы, церви-кального канала, уретры, парауретральных ходов. Данный метод используется и в настоящее время. Недостатками его является то, что он информативен при острых формах и при инфекции нижне­го полого тракта. Чувствительность данного метода составляет от 10 до 40%.

Распространенным методом диагностики хламидийной инфек­ции является метод прямой и непрямой иммунофлюоресценции. Он относительно простой и недорогой, основан на определении антигена Chlamydia trachomatis. Меченные флюоресцином моно-клональные антитела прикрепляются к элементарным тельцам, присутствующим в исследуемом материале. Чувствительность дан­ного метода составляет 90-100%, специфичность — 85-100%. Од­нако данный метод, как и цитологический, информативен при инфицировании нижних отделов урогенитального тракта, а субъ­ективизм в оценке результатов анализа ограничивает его диагнос­тическую ценность.

Метод иммуноферментного анализа основывается также на выявлении антигена хламидий в пораженных клетках. Преиму­ществами его в диагностике хламидийной инфекции являются простота транспортировки и хранения полученных материалов, объективности оценки результатов, возможности автоматизации и одновременного исследования большого количества проб. К недо­статкам относят высокий показатель ложноотрицательных и ложноположительных результатов, особенно при обследовании «бессимптомных» групп низкого риска, отсутствие возможности оценки качества забранного материала. Использование данного метода информативно также при инфекции нижнего отдела уроге­нитального тракта. В настоящее время этот метод не рекомендует­ся для исследования материала из конъюнктивы, однако он все чаще применяется при изучении материала из шейки матки и уретры в лабораториях, исследующих большое количество проб.

К молекулярным методам диагностики относятся все виды ПЦР, при которой выделяют возбудителя по нескольким копиям ДНК. Этот высокочувствительный метод позволяет с достовер­ностью определять хламидийную инфекцию, однако есть опас-

—------------------------------------ Глава 3 -------------------------------------------

ность гипердиагностики хламидиоза при широком использовании этого метода для скринингового обследования пациентов вследствие невозможности дифференцирования мертвых и живых хламидий.

Наряду с выявлением антигенов или возбудителя в биоматери­але достаточно широко используются серологические методы, основанные на выявлении противохламидийных антител и опре­деления их титров в сыворотке больного. При неосложненных инфекциях половых органов специфические антитела не выраба­тываются, однако повышенные уровни этих антител часто выявляются у женщин с воспалением тазовых органов или с пери-гепатитом.

Определение классов специфических иммуноглобулинов (IgM, IgA, IgG) в сыворотке крови пациентов позволяет выявить как ран­ние стадии инфекционного процесса верхнего отдела полового тракта женщины (IgM), так и обострение хронического (IgA, IgG), а также контролировать эффективность лечения по изменению уровня специфичных антител. В сомнительных случаях полезным может быть исследование увеличения титра антител, проведенное через 2 недели после первого исследования.

Определение специфических антител также информативно у новорожденных, поскольку обнаружение IgM у младенца с пнев­монией указывает на хламидийную этиологию.

Говоря о методах диагностики хламидийной инфекции, необхо­димо отметить, что ни один из них не является универсальным. По­этому рекомендуется проводить исследование на хламидийную ин­фекцию, используя одновременно как минимум два метода.

Цитомегаловирусная инфекция

Вирус может быть выделен из амниотической жидкости, гло­точного мазка или мочи инфицированного младенца. Наиболее достоверно выделение в материале самого вируса или его ДНК. «Золотым стандартом» до сих пор остается вирусологический метод. Для выявления антигена используют реакцию иммунофлю-оресценции (РИФ), иммуноферментный анализ (ИФА), ДНК-гибридизацию, полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Специфи­ческие антитела IgM и IgG класса определяют иммуноферментным методом. Обнаружение ЦМВ-специфических IgM-антител в еди­ничной пробе крови указывает на недавнюю первичную или теку­щую (рецидивирующую) инфекцию. Определение IgG CMV должно

_--------------------------------- — Глава 3 --------------------------------------------

осуществляться одновременно с определением IgM, особенно для диагностики первичной инфекции. Однократно определенный по­вышенный титр специфических антител класса IgG CMV не явля­ется диагностическим критерием острой фазы инфекции. Опреде­ление IgG-антител необходимо проводить в парных сыворотках с интервалом не менее 10 дней. Сероконверсия в период между дву­мя пробами крови может свидетельствовать о текущей инфекции.

Первичную инфекцию при беременности можно выявргть с по­мощью лабораторного исследования крови. После первичного ин­фицирования IgM-антитела персистируют до 16 недель, поэтому специфические IgM-антитела могут обнаруживаться в ранние сро­ки беременности, если инфицирование произошло еще до зачатия.

Врожденная инфекция может быть подтверждена либо путем выделения вируса из глоточного мазка или пробы мочи, взятых в течение первых трех недель жизни новорожденного, либо путем вы­явления ЦМВ-специфических IgM-антител в крови младенца или в пуповинной крови. В более поздние периоды жизни поставить диа­гноз врожденной ЦМВ-инфекции не представляется возможным. Определение IgM-антител после трех недель жизни может указы­вать на недавно развившуюся неонатальную или постнеонаталь-ную инфекцию, а выделение вируса в среду происходит постоянно у детей как с приобретенной, так и с врожденной инфекцией.

Энтеровирусы

Энтеровирусные инфекции обычно диагностируют путем выде­ления в клеточной культуре вируса из испражнений, глоточных мазков, спинномозговой жидкости, крови, мазков кожных пора­жений или секционного материала. Выделение вируса возможно только в тех лабораториях, где имеются условия для обнаружения возбудителя в культуре ткани. Таким способом могут быть выяв­лены вирусы Коксаки группы В и ECHO, некоторые штаммы Коксаки группы А. Серологический анализ, выявляющий IgM-антитела против энтеровирусов, может иметь определенное ретро­спективное значение, особенно при вспышках, но он мало приго­ден на острой стадии инфекций у новорожденных. Следует иметь в виду возможность перекрестных реакций между различными се-ротипами вирусов, поэтому зачастую трудно или невозможно се­рологическим путем установить, каким именно типом вируса вызвано заболевание.

--------------------------------------- Глава 3 -------------------------------------------

Escherichia coli

Материалом для исследования у беременной женщины может быть среднесуточная порция мочи, кровь, амниотическая жид­кость, полученная путем амниоцентеза, выделения из влагалища (заднего свода). У младенцев (при подозрении на инфицирование) материалом для исследования может быть кровь, желудочный ас­пират, мазок из уха, моча, пробы с других участков.

Е. coli легко выделяется в бактериальной культуре наряду с дру­гими потенциально патогенными бактериями, включая разновид­ности энтеробактерий и анаэробы.

При культивировании микроорганизмов экспресс-методы идентификации энтеробактерий могут обеспечить результат в тот же день. Более важным преимуществом данного метода является то, что в тот же день, когда выделена гемокультура или другая культу­ра E.coli, могут быть получены результаты определения антибио-тикочувствительности, поскольку чувствительность к антибиоти­кам иногда может быть определена после 8-часовой инкубации.

При септицемии или менингите, вызванных грамотрицатель-ными бактериями, в крови или спинномозговой жидкости может быть обнаружен эндотоксин. Высокочувствительным методом об­наружения эндотоксина является тест с лизатом Limulus.

Многие различные типы E.coli можно идентифицировать путем анализа антигенов, которые находятся в клеточной стенке (О-серо-типы) и капсуле (К-антигены). Эти типы имеют большое значение, так как могут коррелировать со специфическими инфекциями. Методами обнаружения является латексная агглютинация.

Среди других лабораторных тестов используют количественное определение С-реактивного белка (СРБ) как ориентировочный по­казатель бактериальной инфекции у младенцев, которые находят­ся в тяжелом состоянии, но без признаков явного сепсиса. Высокие (> 80 мг/л) или возрастающие уровни СРБ могут служить основа­нием для срочного назначения антибиотикотерапии, а серийные пробы позволяют осуществлять мониторинг противомикробной терапии.

К числу других неспецифических показателей наличия сепсиса, вызванного E.coli, относятся следующие: нейтропения, нейтропе-ния с наличием незрелых форм лейкоцитов и тромбоцитопения; увеличение продуктов деградации фибрина; удлинение протромби-нового времени. О наличии тяжело протекающего сепсиса могут свидетельствовать также повышение билирубина и трансаминаз.

—----------------------------------- Глава 3 -------------------------------------------

Вирусный гепатит В (HBV)

Диагностика вируса гепатита В основывается на серологичес­ком исследовании крови. Маркерами вирусного гепатита В явля­ются следующие:

— поверхностный антиген гепатита В (HBsAg) и антитела к не­му (анти-HBs);

— антитела к ядерному антигену гепатита В (анти-НВс, анти-НВс IgM);

— е-антиген гепатита В (HBeAg) и специфические антитела к нему (анти-НВе).

Пациенты, у которых обнаруживается HBsAg (HBsAg — поло­жительны), трактуются как инфицированные вирусом гепатита В; его обнаружение в крови на протяжении 6 месяцев и более свиде­тельствует о хроническом течении процесса. Этот маркер не несет информации об активности гепатита. Поэтому его выявление в крови служит только основанием для исследования других марке­ров гепатита В. Те, у кого обнаруживаются HBeAg, расцениваются как высоко инфекционные и опасны для окружающих. HBeAg — маркер фазы размножения (репликации вируса), который может выявляться как при остром, так и при хроническом гепатите В. На­личие этого показателя учитывается при решении вопроса о прове­дении противовирусного лечения. Как только пациент начинает выздоравливать, происходит потеря е-антигена, и начинают обра­зовываться антитела НВе и антитела HBs.

Анти-HBs — это антитела, которые обнаруживаются у лиц, вы­здоровевших или вакцинированных от гепатита. Это показатель иммунной защиты организма от вируса гепатита В. О степени на­дежности этой защиты свидетельствует количественный уровень анти-HBsAg в крови пациента.

Анти-НВе — антитела появляются в крови после исчезновения HBeAg и, как правило, свидетельствуют о прекращении размноже­ния вируса. Однако существует измененная (мутантная) разновид­ность вируса гепатита В, при инфицировании которой активное размножение вируса сохраняется при наличии анти-НВе. Беремен­ная женщина с положительным HBsAg должна параллельно обследоваться на анти-HBs, которые указывают на наличие пере­несенной инфекции. Если HBsAg сохраняются в течение более 6 месяцев, это свидетельствует о хроническом течении болезни. Да­же после выздоравливания пациенты могут быть носителем анти­гена в течение года и более. Исследование уровня трансаминаз

--------------------------------------- Глава 3 -------------------------------------------

печени необходимо для дифференцирования между симптоматиче­ским хроническим течением, хроническим персистирующим гепа­титом и хроническим активным гепатитом. Результаты скрининга на гепатит В у беременной могут указывать на то, что новорожден­ному необходимо как можно скорее после рождения ввести имму­ноглобулин и вакцину против гепатита В.

Существуют разнообразные тесты, применяемые при HBV-ин-фекции. В настоящее время в основном применяют серологические исследования крови (РИА или ИФА).

Вирусный гепатит С (HCV)

Диагностика вируса гепатита С также основывается на сероло­гическом исследовании крови. Маркерами вирусного гепатита С являются: антитела HCV и прямое обнаружение вируса гепатита С в сыворотке крови.

Для обнаружения антител HCV используют иммуноферментные технологии (ELISA). Недостатком данного метода является тот факт, что пациенты с HCV-инфекцией могут вырабатывать антите­ла до года. Кроме того, количество вырабатываемых организмом антител может быть незначительным и не обнаруживаться данным методом даже при наличии активной, инфекционной болезни. Результаты HCV, следовательно, должны интерпретироваться с учетом анамнеза и объективного статуса, а также результатов вспо­могательных лабораторных исследований.

Для подтверждения тест-положительных результатов иммуно-ферментного анализа используется рекомбинантный иммуноблот-метод (Western blot).

Наиболее специфическим диагностическим методом на сегод­няшний день является ПЦР, которая заключается в полимеразном цепном увеличении вирусного антигена в клинических экземпля­рах для его прямого обнаружения.

Вирусный гепатит Д (HDV)

Лабораторная диагностика HDV-инфекции обычно основывает­ся на определении антител в сыворотке пациента (анти-HDV). В острой фазе болезни специфический анти-HDV IgM может опреде­ляться, хотя IgM может оставаться в низких титрах в случаях пер-систирующей HDV-инфекции. Анти-HDV IgG появляются позже. Для определения антител в сыворотке применяется Western blot, методика которого более чувствительна, чем иммуноферментные

--------------------------------------- Глава 3 --------------------------------------------

методы. В научно-исследовательских лабораториях используется метод молекулярной гибридизации, что позволяет обнаружить РНК HDV в клинических экземплярах. Следует отметить, что об­следованию на HDV подлежат пациенты с гепатитом В, поскольку HDV — маленькая круглая полоска РНК, которая связана со спе­цифическим антигеном (HDVAg), покрытым HbsAg.

Вирусный гепатит Е (HEV)

Диагноз HEV-инфекции ставится на основании исключения другого инфекционного гепатита.

Вирус простого герпеса

Вирус может быть обнаружен в жидкости везикул, спинномозго­вой жидкости (СМЖ) и тонких срезах инфицированных тканей на секции; у новорожденных — на коже, в полости рта, глотки, носо­вой полости, глаз и СМЖ. Достоверным методом лабораторной ди­агностики инфекции является культуральное выделение вируса. Однако для этого нужны специализированные микробиологичес­кие лаборатории.

Обнаружение антигенов ВПГ в биологических жидкостях или в клетках является прямым доказательством активной репликации вируса и, следовательно, однозначно подтверждает этиологию забо­левания. Для выявления антигенов ВПГ широко применяется ме­тод РИФ. Характеризуя метод РИФ, следует подчеркнуть как его преимущества (специфичность, экспресс-метод, доступность, невы­сокую стоимость), так и недостатки (относительно невысокую чув­ствительность, зависимость диагностической эффективности от стадии заболевания, высокий уровень субъективности при учете результата).

Цитоморфологические методы позволяют выявить индуциро­ванные вирусом морфологические изменения в клетках и тканях пораженных органов. Эти методы делятся на две группы: в одних используется световая, в других — электронная микроскопия. При использовании световой микроскопии в зонах поражения отмеча­ется типичный для герпеса метаморфоз клеток и ядер. К недостат­кам световой микроскопии следует отнести их неспецифичность, невозможность дифференцирования первичной инфекции от реци­дивирующей, невозможность дифференцирования типа ВПГ.

Электронно-микроскопическое исследование позволяет обнару­жить в биопробах характерные по морфологии частицы ВПГ. Огра-

--------------------------------------- Глава 3 --------------------------------------------

ничениями при использовании электронно-микроскопических методов является их неспецифичность, невозможность дифферен­цирования первичной и рецидивирующей инфекции и типа ВПГ, труднодоступность оборудования и отсутствие подготовленного персонала. Новейшим методом диагностики генитального герпеса является метод ПЦР.

Для выявления антител к антигену ВПГ используют классичес­кие серологические методы, а также ИФА, чувствительность которого на 2-4 порядка выше по сравнению с классическими серо­логическими методами.

Обнаружение ВПГ-специфических IgM-антител в единичной пробе крови указывает на недавнюю первичную или текущую (рецидивирующую) инфекцию. Определение IgG ВПГ должно осуществляться одновременно с определением IgM, особенно для диагностики первичной инфекции. Однократно определенный повышенный титр специфических антител класса IgG ВПГ не яв­ляется диагностическим критерием острой фазы инфекции. Опре­деление IgG-антител необходимо проводить в парных сыворотках с интервалом не менее 10 дней. Сероконверсия в период между дву­мя пробами крови также свидетельствует о текущей инфекции.

Исследование же сыворотки новорожденных на антитела к ВПГ не информативно, поскольку невозможно интерпретировать факт обнаружения IgG-антител к ВПГ из-за присутствия материнских антител, прошедших через плаценту. В этом случае диагностичес­кую ценность приобретает определение специфических IgM-анти­тел в сыворотке новорожденного.

Листериоз

Подозрение на листериоз может возникнуть в тех случаях, ког­да беременные страдают атипичным лихорадочным состоянием, а также при преждевременных родах. Следует брать пробы влага­лищных секретов, мочи и крови для бактериологического анализа и посева. Для этих целей обычно требуются специальные среды.

В последние годы разработана методика фаготипирования, од­нако 36% штаммов являются нетипируемыми.

При гистологическом исследовании плаценты выявляются та­кие характерные изменения, как микроабсцессы диаметром до 10 мм, воспаление ворсин и пуповины, а также хориоамнионит.

Анализ материнской крови на наличие антител обычно бывает малоэффективным, но его можно применять для определения Listeria как вероятной причины недавнего выкидыша.

--------------------------------------- Глава 3 -------------------------------------------------

У новорожденных Listeria могут быть высеяны из прямой киш­ки, с поверхности кожи, из крови и спинномозговой жидкости. Возбудитель может быть также высеян из первых порций выделен­ного мекония. При окраске по Граму мазков желудочного аспирата, взятых у младенца при болезни с ранним началом, обычно обнару­живаются полиморфно-ядерные лейкоциты и грамположительные микроорганизмы.

Neisseria gonorhoeae

Диагноз гонореи может быть легко поставлен с помощью мето­дов культивирования возбудителя. В этих случаях следует брать материал из уретры, шейки матки и прямой кишки. Другие методы выявления возбудителя дают менее удовлетворительные результа­ты, а исследование крови совершенно не эффективно. Методы культивирования обладают высокой чувствительностью, но при этом требуется, чтобы забранный материал был направлен в лабо­раторию в соответствующих транспортных средах. Необходимо от­метить, что ни в одной транспортной среде гонококки полностью не сохраняются на протяжении более 24 часов. Культуральная иден­тификация возбудителя включает оксидазную реакцию и реакцию расщепления декстрозы. Преимуществом культурального метода обнаружения гонококка является возможность одновременно проводить определение антибиотикоустойчивости, поскольку в на­стоящее время у больных циркулируют штаммы, устойчивые к пенициллину и другим антибиотикам. Обнаружение гонококка по­средством выявления антигена с помощью ИФА или РИФ менее эффективно, чем культуральный метод. Окраска препаратов мети-леновым синим и по Граму имеет только указательный характер и не может использоваться для постановки диагноза. В последнее время для обнаружения Neisseria gonorrhoeae используют молеку-лярно-биологические методы — ПЦР и ЛЦР.

Корь

Клинические симптомы кори делают в большинстве случаев не­нужной лабораторную диагностику. Антитела, выявляемые при ИФА, увеличиваются по мере нарастания сыпи и достигают пика к десятому дню (около четырех недель после вакцинации).

IgM и IgG появляются одновременно, но IgM исчезает к 90-му дню от начала заболевания, a IgG снижаются к шестому ме­сяцу и остаются на стабильном уровне.

—------------------------------------ Глава 3 -------------------------------------------------

Парвовирус В19

Не существует традиционных методов исследования клеточных культур для парвовируса В19. Однако разработаны специальные методики, основанные на использовании первичных культур кле­ток-предшественников кроветворного ряда из костного мозга чело­века или печени плода. Однако эти методы применяются только при научных исследованиях. На практике используется метод ДНК-гибридизации, основанный на выделении нуклеиновых кис­лот. Для подтверждения тестов на вирус В19 могут применяться некоторые другие тесты. Надежным средством для обнаружения вируса является электронная микроскопия, поскольку при данной инфекции часто отмечается В19-виремия и достаточное количество частиц вируса может быть визуально определено при негативной окраске. Данный метод может быть использован для исследования тканей.

Для обнаружения антигена В19 используют ряд методов — в час­тности, реакцию встречного иммуноэлектрофореза и радиоимму-ноанализа. Реакция вируса В19 в тестах по определению антигена может быть снижена или блокирована за счет одновременного при­сутствия специфических антител в пробах сыворотки или тканей.

Наиболее широко используемыми тестами на IgM и IgG к В19 в настоящее время являются разные варианты радиоиммуноанали-за. Количественное определение IgM-антител к В19 необходимо для диагностики недавно развившейся инфекции. Количественные по­казатели IgG к В19 определяют в целях получения доказательства ранее перенесенной инфекции и наличия иммунитета.

Наиболее информативным диагностическим тестом является выявление IgM-антител к В19. Диагноз В19-инфекции при бере­менности должен основываться на обнаружении у матери IgM-антител к В19. Беременных женщин, которые имели контакт с больными, следует тестировать на IgM и IgG-антител к В19. Для вы­явления инфицированных эмбрионов применяются такие методы, как определение уровней сывороточного альфа-протеина, ультра­звуковая диагностика и исследование крови плода на IgM-анти-тела к В19. При выкидышах или гибели плода в результате материнской инфекции необходимо проводить исследование пла­центы и тканей плода на наличие В19.

Можно исследовать с помощью прямых тестов на обнаружение вируса В19 пуповинную кровь, глоточные мазки и другие пробы, взятые у новорожденного. Но очень часто имеют место отрицатель-

--------------------------------------- Глава 3 -------------------------------------------

ные результаты. В этих случаях проводят исследование ребенка в возрасте 1 год. К этому времени титры антител, пассивно передан­ных плоду от матери, падают до невыявляемого уровня и при нали­чии инфекции определяются собственные антитела.

Краснуха

Весьма важно, чтобы беременные женщины с заболеваниями, похожими на краснуху или контактировавшие с такими больны­ми, были обследованы как можно быстрее. Материалом для иссле­дования является сыворотка крови.

Существует ряд методик выявления антител против вируса краснухи, которые позволяют проводить количественную оценку уровней антител и тем самым использовать ее для диагностики ин­фекции при нарастании титров антител. К методикам, чаще всего применяющимся для скрининга антител при краснухе, относятся радиальный гемолиз (РГ), иммуноферментный анализ (ИФА) и ла­текс-агглютинация (ЛА). Для выявления нарастания титров анти­тел часто применяют реакцию торможения гемагглютинации (РТГА) и ИФА.

Серологическая диагностика краснухи может быть проведена путем обнаружения значительного подъема титров антител IgG (более чем в 4 раза) или выявления специфических IgM-антител к вирусу краснухи.

Существенный подъем титров антител может быть выявлен в те­чение первых 4-7 дней после появления симптомов, хотя иногда серологический ответ может задержаться до 10 дней. При обследо­вании беременной женщины важно подтвердить полученные результаты с помощью альтернативного метода (например, опреде­ление специфических IgM-антител или путем исследования второй пробы сыворотки).

Специфические IgM-антитела обычно обнаруживаются в тече­ние 6-8 недель после контакта, в отдельных случаях они могут быть выявлены к четвертой неделе после начала болезни.

Пренатальная диагностика имеет значение для решения вопро­са о том, произошло ли инфицирование плода. Теоретически име­ются три возможных метода постановки пренатального диагноза врожденной инфекции:

1. Обнаружение вируса, вирусных антигенов или нуклеиновой кислоты в биоптатах хориона.

---------------------- —------------- Глава 3 -------------------------------------------

2. Обнаружение вируса, вирусных антигенов или нуклеиновой кислоты в амниотической жидкости.

3. Обнаружение специфических IgM-антител в крови плода, по­лученной при кордоцентезе.

Диагноз врожденной краснухи обычно ставят путем исследова­ния пуповинной крови, а также сыворотки новорожденного или младенца на наличие специфических IgM-антител. Отсутствие спе­цифических IgM-антител в неонатальный период, по существу, ис­ключает диагноз врожденной краснухи.

Диагноз можно поставить на основании выделения вируса крас­нухи из глоточных мазков или мочи. При этом вирус обнаружива­ется у большинства новорожденных с врожденной инфекцией. Обнаружение специфических IgG-антител в период от 1 года до 2-х лет жизни ребенка указывает на вероятность врожденной ин­фекции, так как инфицирование детей краснухой в этом возрасте происходит довольно редко.

Стрептококк группы В

Материалом для исследования у беременной женщины может быть среднесуточная порция мочи, кровь, выделения из влагалища (заднего свода). У младенцев (при подозрении на инфицирование) материалом для исследования может быть кровь, желудочный ас­пират, мазок из уха, моча, пробы с других участков, спинномозго­вая жидкость.

Штаммы стрептококка группы В быстро и постоянно растут на средах, обогащенных глюкозой, кровью или сывороткой. К другим методам диагностики относится обнаружение антигена в крови, спинномозговой жидкости и моче. Имеется ряд наборов промыш­ленного производства, основанных на разнообразных иммунологи­ческих методах выявления стрептококкового антигена группы В. Точные данные о проценте ложноположительных и ложноотрица-тельных результатов у разных авторов варьируют, однако в целом эти тесты являются достаточно надежными. Особенно пригодны они в тех случаях, где высока вероятность их обнаружения. Как правило, методы обнаружения антигена — это экспресс-тесты, ко­торые занимают 30 минут. Многие современные полуавтоматичес­кие методы позволяют получить культуру грамположительных кокков во флаконе в течение суток. Обнаружение антигена груп­пы В во флаконе дает возможность быстро поставить ориентиро­вочный диагноз.

—----------------------------------- Глава 3 --------------------------------------- —

Сифилис

Для установления диагноза сифилиса используют как бактерио-скопическое, так и серологическое исследование крови.

Наиболее убедительным доказательством трепонемной природы заболевания является прямая визуализация трепонемы. При пер­вичном сифилисе на бледную трепонему исследуют отделяемое эро-зивно-язвенных папулезных элементов в области половых органов, полости рта, в пунктате из регионарных лимфатических узлов. При вторичном сифилисе используется материал из различных поражений кожи и слизистых оболочек. Для диагностики врож­денного сифилиса может быть использована амниотическая жидкость. При отрицательных результатах микроскопическое ис­следование повторяют либо до обнаружения бледной трепонемы, либо до подтверждения диагноза результатами серологического ис­следования. В последнее время для обнаружения ДНК бледной тре­понемы применяют ПЦР.

Серологические исследования крови основаны на определении антител, которые вырабатываются при сифилисе и классифициро­ваны как неспецифические и специфические антитела против тре-понем.

Специфические антитела против трепонем вырабатываются в ответ на инфекцию, вызываемую трепонемами. Как и при других инфекциях, вначале появляются антитела класса IgM, а затем — IgG-антитела. IgM-антитела можно выявить у пациентов с первич­ным, вторичным или врожденным сифилисом, а также при реин-фекции. В целом титры IgM-антител снижаются после лечения, однако скорость снижения зависит от стадии болезни, при которой проводилось лечение; антитела снижаются быстрее после ранее на­чатого лечения. При позднем или неполном лечении антитела мо­гут персистировать в течение длительного периода.

Образование IgG-антител следует за выработкой IgM-антител и обычно достигает более высокого уровня. Хотя титры IgG-антител могут со временем снижаться, они персистируют в течение всей жизни пациента даже при адекватном лечении.

Неспецифические антитела против трепонем включают анти­тела против группового антигена и кардиолипина (антилипидные антитела). Антилипидные антитела выявляются на ранних стади­ях течения инфекции и достигают высоких уровней к началу вторичного периода. После проведенного лечения титры антител снижаются до уровня, который зависит от стадии, при которой бы-

------------------------------- Глава 3 ------------------------------

ло начато лечение. Данные уровни могут снижаться по мере про-грессирования инфекции до поздней стадии (даже при отсутствии терапии). Реинфекция приводит к увеличению титров антител.

Существует множество тестов для количественной оценки анти­тел против липидов. Тесты фиксации комплемента (например, ре­акция Вассермана) в настоящее время в мире применяются очень редко, так как они не имеют преимуществ по сравнению с совре­менными тестами флоккуляции, тестом Venereae Disease Research Laboratory (VDRL) или экспресс-тестом, основанным на микропре­ципитации с кардиолипиновым антигеном с плазмой крови (RPR), которые более простые, быстрые, а также дешевле в исполнении.

Скрининговые и подтверждающие тесты на сифилис представ­лены в таблице 3.1. Серологический скрининг проводится с помощью анализа крови, взятого в первый визит пациентки, с при­менением стандартных тестов — нетрепонемных, таких как VDRL (Veneral Disease Research Laboratory) или RPR (Rapid Plasma Reagin). Эти тесты обнаруживают нетрепонемные антитела и явля­ются неспецифическими, поэтому все положительные или сомни­тельные результаты должны быть подтверждены с помощью специфических трепонемных тестов, таких как тест иммобилиза­ции Treponema pallidum (Treponemapallidum immobilization test — TPI) и реакция иммунофлюоресценции-абсорбции (FTA-ABS — fluorescent treponemal antibody absorption).

После того, как получен первичный положительный результат какого-либо теста по определению антилипидных антител, необхо­димо определить титры этих антител. Данные тесты обладают огра­ниченной специфичностью, но они пригодны для диагностики трепонемной инфекции, поскольку дают положительный результат в начальной стадии и являются достоверными маркерами активно­сти инфекционного процесса.

Достоверным способом оценки активнос