Определение активности ФПФазы

 

Для определения активности ФПФазы используют реакцию гидролиза паранитрофенилфосфата (пНФФ), которая происходит по следующей схеме:

Паранитрофенол (пНФ) в отличие от пНФФ в щелочной среде имеет желтый цвет с максимумом поглощения при длине волны 410 нм. На этом свойстве основан принцип количественного определения продукта реакции.

Для определения активности ФПФазы используют следующие растворы.

Реактивы: 0,3 М Na-ацетатный буфер рН 5,8,3 мМ пНФФ в0,3 М Na-ацетатном буфере рН 5,8 (2,5 мг пНФФ растворяют в 1 мл буфера), 0,1 н NaOH, препарат фермента.

Оборудование: термостат, спектрофотометр, автоматические пипетки, пробирки, штатив.

Ход работы

Все растворы перед определением активности нужно прогреть при 37 °С в течение 5 – 10 минут. Затем приготавливают пробы по следующей схеме:

 

Проба	Буфер А, мкл	Субстрат, мкл	Препарат фермента, мкл
Опыт
Контроль

 

Ферментативную реакцию проводят при 37 °С в течение 15 минут. После инкубации реакцию останавливают добавлением 3 мл0,1 МNaOH. Опытная проба должна окрашиваться в желтый цвет. Контрольная проба – бесцветная. Желтый цвет в опытной пробе обусловлен присутствием в ней пНФ. После остановки реакции измеряют оптическую плотность раствора при 410 нм.

Количество полученного продукта определяют по интенсивности окраски пНФ в щелочной среде, используя молярный коэффициент экстинкции, равный 17,9 · 10³ М^-1 см^–1 по формуле:

Е₄₁₀ · V

Х = –––––––––––––,

17,9 · 10³

где:

Х – количество пНФ в пробе (моль);

Е₄₁₀ – оптическая плотность опытной пробы;

V – объем пробы после остановки реакции (л);

17,9 ·10³ М^-1_.см^–1 – молярный коэффициент экстинкции.

Определив количество гидролизированного субстрата, расчитывают скорость ферментативной реакции, которую выражают в нмолях гидролизованного субстрата за 1 мин. Затем в пробе определяют количество фермента в единицах активности. За единицу активности принимают количество фермента, которое гидролизует 1 нмоль субстрата за 1 минуту.

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА В БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

Хроматографические методы анализа

Спектральные методы анализа

Электрохимические методы анализа

Лекция 5. Методы исследования органических соединений

1. Масс спектрометрия;

2. Электронная спектроскопия;

3. Инфракрасная спектроскопия;

4. Спектроскопия ЯМР.

Химия – это область научных знаний и практической деятельности, которая развивается за счет синтеза новых соединений и создания материалов на их основе. Главной задачей химика-исследователя после синтеза соединения или комбинации известных соединений (материалов) является установление строения молекул или молекулярных ассоциатов.

МЕТОДЫ АНАЛИЗА
Химические	Физические
Элементный анализ; Геометрия молекулы; Химический анализ; Встречный синтез.	Осколочная масс-спектрометрия; Молекулярная спектроскопия: - электронная; - инфракрасная; - ядерного магнитного резонанса; и др.

Масс-спектрометрия

Применяется для идентификации и определения молекулярной массы и молекулярной формулы вещества.

Молекулы, находящиеся в парообразном состоянии в глубоком вакууме, подвергаются бомбардировке электронами. Молекулы в этих условиях теряют один электрон. Образующийся молекулярный ион последовательно распадается на осколки-катионы, свободные радикалы или молекулы.

Молекулярная спектроскопия

Методы основаны на взаимодействии электромагнитного излучения с молекулами вещества.

Свет – распространение электромагнитных волн в пространстве.

Как любое электромагнитное колебание характеризуется скоростью, длиной волны и частотой.

Методы молекулярной спектроскопии основаны на взаимодействии вещества или смеси веществ, их растворов с различного вида излучениями. К ним относятся электронная, инфракрасная спектроскопия; метод люминесценции, оптический и рентгеновский спектральный анализ; рефрактометрия; поляриметрия; метод ядерного магнитного резонанса. На взаимодействии с магнитным полем основан метод электронного парамагнитного резонанса, последовательно с электрическим и магнитым – масс-спектрометрия.

В настоящее время спектрофотометрические методы с большим успехом используются при решении таких вопросов, как контроль чистоты химических соединений, идентификация, установление структуры, исследование различных видов изомерии, количественный анализ смесей, определение констант диссоциации кислот и оснований, исследование кинетики химических реакций, определение микропримесей и т.д.

Электронная спектроскопия

Изучает поглощение органическими веществами света в УФ области спектра (200-400 нм). Излучение с такой длиной волны поглощают только соединения, с p-связями (С=О, С=С).

Поглощение света вызвано электронными переходами:

ИК-спектроскопия

Инфракрасные спектры возникают в результате возбуждения колебаний атомов и целых группировок в молекуле в результате поглощения тепловых квантов энергии, расположенных от 760 нм спектра.

Колебательные движения молекул

Структурный анализ по ИК-спектрам сводится в настоящее время к отысканию характеристических полос поглощения и их отнесению к соответствующим структурным элементам с учетом численных значений частот max поглощения, контура (формы) и интенсивности полос.