Заглавная страница Избранные статьи Случайная статья Познавательные статьи Новые добавления Обратная связь FAQ Написать работу КАТЕГОРИИ: АрхеологияБиология Генетика География Информатика История Логика Маркетинг Математика Менеджмент Механика Педагогика Религия Социология Технологии Физика Философия Финансы Химия Экология ТОП 10 на сайте Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрацииТехника нижней прямой подачи мяча. Франко-прусская война (причины и последствия) Организация работы процедурного кабинета Смысловое и механическое запоминание, их место и роль в усвоении знаний Коммуникативные барьеры и пути их преодоления Обработка изделий медицинского назначения многократного применения Образцы текста публицистического стиля Четыре типа изменения баланса Задачи с ответами для Всероссийской олимпиады по праву Мы поможем в написании ваших работ! ЗНАЕТЕ ЛИ ВЫ?
Влияние общества на человека
Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрации Практические работы по географии для 6 класса Организация работы процедурного кабинета Изменения в неживой природе осенью Уборка процедурного кабинета Сольфеджио. Все правила по сольфеджио Балочные системы. Определение реакций опор и моментов защемления |
Из клеточных ядер селезенки быкаСодержание книги
Похожие статьи вашей тематики
Поиск на нашем сайте
ФПФазы катализируют дефосфорилирование белков. Фосфорилирование же белков осуществляют протеинкиназы. Специфическое и обратимое фосфорилирование аминокислотных остатков в молекулах белков играет важную роль в регуляции метаболизма. Существует очень большое разнообразие молекулярных форм ФПФаз, которые отличаются друг от друга субстратной специфичностью, кинетическими параметрами, субъединичным составом, локализацией и другими параметрами. В данной работе рассматривается ФПФаза клеточных ядер. Этот фермент обладает широкой субстратной специфичностью, катализирует дефосфорилирование не только фосфопротеинов, но и низкомолекулярных субстратов: АТФ, АДФ, пара-нитрофенилфосфата (пНФФ). Способность ФПФазы дефосфорилировать пНФФ и его чувствительность к некоторым факторам, свидетельствует о том, что этот фермент является тирозиновой ФПФазой.
Часть 1. Выделение клеточных ядер методом дифференциального центрифугирования Целью данного раздела работы является выделение клеточных ядер для дальнейшей экстракции из них ФПФазы. В основе метода дифференциального центрифугирования лежит разность в скоростях седиментации частиц, имеющих разные размеры и плотность. Реактивы: CH3COONa*3H2O, CH3COOH, KCl, MgCl2*6H2O, CaCl2, NaCl, HCl, сахароза, трис. Оборудование: центрифуга, гомогенизатор, ножницы, капроновый фильтр, марля, весы, микроскоп, центрифужные стаканы. Ход работы Перед работой готовят следующие растворы. 1. Буфер А:0,3 МNa-ацетатный буфер рН 5,8. Этот буфер готовят из 2М Na-ацетатного буфера рН 5,8, который получают следующим образом:
2. Буфер В: 10 мМтрис-HCl, рН 7,55, содержащий 0,25 Мсахарозы, 25 мМKCl, 10 мМMgCl2:
3. Буфер С: 10 мМтрис-HCl, рН 7,55, содержащий 3 мМCaCl2:
4. Раствор Д:0,2 М NaCl:
Клеточные ядра выделяют при температуре +4 оС. Выделение ядер включает следующие этапы. 1. После размораживания (2 –80 г) ткань измельчают ножницами. 2. К измельченной ткани добавляют буфер В в соотношении 1 к 4. Затем ткань гомогенизируют в блендоре при максимальных оборотах 1 – 2 мин. 3. Гомогенат фильтруют через 2 слоя марли, затем через капроновый фильтр. Фильтрация необходима для отделения неразрушенных частиц и фрагментов фиброзной ткани. 4. Фильтрат центрифугируют при800 gв течение 7 минут. Центрифугат отбрасывают. 5. Осадок промывают буфером В. Для этого осадок ядер суспензируют в буфере и затем центрифугируют при800 gв течение 7 минут. 6. Осадок промывают буфером С, так же как в предыдущем случае. Этот этап необходим для лизиса эритроцитов. 7. Осадок промывают раствором Д и затем буфером А. Очищенные ядра используют в дальнейшей работе. Часть2. Экстракция ФПФазы из клеточных ядер Для экстракции ферментов используют разные методы. К таким методам относятся: механическое разрушение ткани, ультразвуковая обработка, замораживание – оттаивание, использование различных соединений, которые способствуют салюбилизации ферментов и др. Целью данного раздела работы является определение концентрации Na-ацетатного буфера, которая более всего подходит для экстракции ФПФазы. Реактивы: 2М Na-ацетатный буфер рН 5,8. Оборудование: центрифуга, гомогенизатор, центрифужные стаканы. Ход работы Для экстракции ФПФазы мы будем использовать 0,4, 0,6, 0,8 и1 МNa-ацетатный буфер рН 5,8. Эти буферы готовят из 2М Na-ацетатного буфера рН 5,8. Для экстракции ФПФазы к осадку ядер добавляют 4- кратный объем буфера соответствующей концентрации. Осадок ядер тщательно суспензируют и оставляют нахолоду на 20 мин. Далее суспензию центрифугируют, надосадочную жидкость используют в качестве препарата фермента. В пробах определяют активность фермента (лабораторная работа №12) и содержание белка (лабораторная работа №7). На основание этих данных рассчитывают общую и удельную активность препаратов ФПФазы. Результаты заносят в таблицу.
На основании полученных данных сделайте вывод, какую концентрацию буфера предпочтительнее использовать.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Последнее изменение этой страницы: 2016-12-16; просмотров: 478; Нарушение авторского права страницы; Мы поможем в написании вашей работы! infopedia.su Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. Обратная связь - 18.222.184.207 (0.01 с.) |