Опыт 11. Определение активности пероксидазы по Бояркину

Метод основан на измерении времени, за которое опытный раствор достигает определенной оптической плотности.

В качестве субстрата используется бензидин, в результате окисления которого образуется соединение синего цвета.

Материалы и оборудование: клубни картофеля, 1% раствор гидрохинона, 3% раствор перекиси водорода.

Ножи, терки, марля, воронки, конические колбы на 50 мл, пробирки в штативе, пипетки на 1 и 10 мл.

Растения комнатные, проростки пшеницы, ячменя или других культур, клубни картофеля, ацетатный буферный раствор с рН 5,4; раствор бензидина на ацетатном буфере; 0,03% раствор перекиси водорода.

Мерные колбы на 25 мл, пипетки на 2 мл, фарфоровые ступки с пестиком, секундомеры, центрфуга с пробирками, ФЭК.

Приготовление бензидина. В мерную колбуна 200 мл, наполненную на 2/3 дистиллированной водой прибавляют 2,3 мл (2,4 г) ледяной уксусной кислоты и 184 мл бензидина. Колбу подогреваютпримерно до 50-60ºС на водяной бане при постоянном взбалтывании. После полного растворения бензидина (10-15 мин) добавляют 5,45 г ацетата натрия, полностью его растворяют, колбу охлаждают и доливают водой до метки. В темном месте раствор можно хранить 7-10 дней.

Ход работы: Растереть в ступке с водой (или с ацетатным буферным раствором рН 5,4) 50-100 мг растительного материала. Перенести его в мерную колбочку на 25 мл и довести до метки. Вытяжку настоять 5-10 мин и отцентрифугировать в течение 10 мин при интенсивности вращения
3000 мин^-1.

Далее работают с надосадочной жидкостью (осадок отбрасывают). В надосадочной жидкости определяют активность пероксидазы, о которой судят по времени образования синей окраски окисленного бензидина.

Для измерения активности лучше брать такие разведения вытяжки, при которых окраска изменяется в течение 10-40 с, т.к. активность фермента прямо пропорциональная его концентрации только в начале реакции. Определение ведут на ФЭК с желтым светофильтром.

В две кюветы толщиной 2 см наливают по 2 мл вытяжки, 2 мл буферного раствора, 2 мл бензидина в каждую. Ставят кюветы в кюветодержатели прибора, одну (контроль), другую (опыт), при помощи оптических клиньев уравнивают оба световых потока (стрелка должна быть в нулевом положении). Уравнивают световые потоки сначала при чувствительности «1», затем при чувствительности «2», при которой и ведут определение. В контрольной кювете оптическую плотность сместить на деление 0,250.

В контрольную кювету наливают 2 мл воды, в опытную – 2 мл 0,03% раствора перекиси водорода пипеткой с широким носиком. Сильной струей перемешать содержимое кюветы. Одновременно с падением первой капли включить секундомер. В опытной кювете раствор синеет и стрелка передвигается к нулевому положению. Отмечают время от начала приливания перекиси водорода до достижения раствором заданной оптической плотности (нулевого положения).

Провести три определения и рассчитать среднее значение. Активность ферментоа рассчитывают по формуле

А = D · (α·β·γ)/ (t· d),

где D – оптическая плотность, равная 0,250; d – толщина слоя жидкости (толщина кюветы), см; t – время, с; α – отношение количества жидкости, взятой для приготовления вытяжки, мл, к массе навески, г; β – степень дополнительного разведения вытяжки (если это потребуется); γ – степень постоянного разведения вытяжки в реакционной смеси (при данных
условиях – 4).

Результаты отражают изменение оптической плотности за 1 с на 1 г сырой массы ткани. Определяют активность пероксидазы в листьях верхнего и нижнего ярусов или в проростках злаков, выращенных в разных условиях. Результаты опыта записывают в таблицу.

Таблица - Определение активности пероксидазы