Опыт 6. Определение внутриклеточной концентрации восстановленного глутатиона при окислительном стрессе.

Окислительным стрессом называют ситуацию, развивающуюся в клетках и тканях при повышении уровня окислителей и нарушении баланса антиоксидантных и прооксидантных факторов в пользу последних. Биологическими окислителями являются активные формы кислорода, в первую очередь кислородные свободные радикалы, а также активные формы азота и хлора. Свободными радикалами называют атомы или молекулы (частицы), несущие неспаренные электроны на внешних орбиталях. Свободные радикалы парамагнитны, обладают высокой реакционной способностью.

Окислительный стресс во многом является следствием аэробного способа существования живых организмов. Молекулярный кислород необходим для аэробных организмов и одновременно потенциально токсичен. В течение 2∙10⁹ лет кислород служит основным акцептором электронов в биологических системах в процессах энергетического обмена. Электронная структура молекулы кислорода позволяет ему последовательно, с поглощением четырех электронов восстанавливаться до молекул воды через промежуточные частично восстановленные формы: супероксиданион О₂ –^.перекись водорода Н₂О₂, и наиболее активный гидроксильный радикал ОН^-. Высокая реакционная способность свободных радикалов (и окислителей нерадикальной природы) обуславливает их токсичность, связанную с неспецифическим повреждающим воздействием белки, нуклеиновые кислоты, липиды. Окислительная модификация белков и липидов существенно нарушает их структуру и функции. Ненасыщенные жирные кислоты липидов способны вступить в цепную радикальную реакцию пероксидации, включающую несколько стадий: инициации, разветвления, терминации. Цепное окислительное повреждение ненасыщенных цепей фосфолипидов сопровождается образованием гидропероксидов и поперечными сшивками ацильных цепей, что резко нарушает структуру и функции биологических мембран: разупорядочивание бислоя, возрастание проницаемости, формирование пор. Целый ряд патологий (в литературе сообщается о более чем 200) в той или иной мере связаны с развитием окислительного стресса. Одна из наиболее распространенных теорий старения – свободнорадикальная теория старения. Биохимические и физиологические повреждения, развивающиеся в клетке при окислительном стрессе, сопровождаются нарушениями клеточного метаболизма, смертью клетки. Свободные радикалы генерируются в клетках в процессах метаболизма (например, в цепи переноса электронов, в реакции фагоцитоза), при действии рентгеновского излучения, при метаболизме ксенобиотиков. Одновременно, свободные радикалы используются клетками как вторичные мессенджеры, участвуют в регуляции важнейших клеточных процессов.

В клетках существует сложная эффективная система антиоксидантной защиты, включающая несколько уровней:

1) компартментализация чувствительных клеточных элементов (например, ДНК),

2) удаление реактивных форм кислорода системой антиоксидантных ферментов: супероксиддисмутаза, каталаза, глутатионпероксидаза,

3) изолирование ионов переходных металлов, например, ферритином,

4) связывание свободных радикалов низкомолекулярными компонентами клетками, клеточными тиолами, в первую очередь восстановленным глутатионом, токоферолом, аскорбиновой кислотой,

5) репарация повреждений,

6) инициация апоптоза.

Важнейшим низкомолекулярным антиоксидантом в клетке является глутатион, концентрация которого достигает 2 –10 мМв клеткак различных тканей. Впервые содержащее серу вещество выделил в1888 г. Де Рей–Пайад и назвал «филотион». Глутатион, трипептид γ–глутамилцистеинглицин, существует в восстановленной (GSH) и окисленной (дисульфидной)(GSSG) формах. Его функции не вполне ясны, он выступает коферментом ряда ферментативных реакций, но основная его функция, защита клетки от окислительного электрофильного стресса.

Реактивы: эритроциты крысы, изотонический раствор хлористого натрия (0.15 М NaCl), реагент Эллмана: 5,5 – дитиобис (2–нитробензойная кислота) 5∙10^–3М, органический трет–бутилгидропероксид ТВООН (100 мМ).

Оборудование: Спектрофотометр СФ–46 (ЛОМО), автоматические пипетки объемом 10 – 100 мкл и 200 – 1000 мкл, пробирки, спектрофотометрические кюветы, весы аналитические, центрифуга лабораторная.

Ход работы

1. Изолируем эритроциты крысы, проливая холодным (4 ⁰С) изотоническим раствором хлористого натрия (0,15 М NaCl). Эритроциты суспензируем в0,15 М NaCl из расчета 1 мл эритроцитов / 6 объемов раствора NaCl, осаждаем эритроциты центрифугированием: 1000 оборотов/мин, 5 минут. Процедуру повторяем 3 раза.

2.Готовим суспензию эритроцитов с 10 % гематокритом.

1) контрольный образец: 2 мл,

2) опытный образец: 2 мл,

3) проба сравнения: 2 мл0.15 Мраствора NaCl.

3. Подвергаем опытный образец окислительному стрессу, используя органический трет–бутилгидропероксид: ТВООН к 2 мл суспензии эритроцитов (образец 2) прибавляем 20 мкл раствора ТВООН (100 мМ), создавая концентрацию окислителя 1 мМ. Инкубируем образец при 22 ⁰С. Органический гидропероксид, взаимодействуя с ионами железа оксигемоглобина эритроцитов, образует алкоксильный ТВО^. и пероксильный ТВОО^. радикалам. Восстановленный глутатион в эритроцитах эффективно расходуется в реакциях детоксикации свободных радикалов, превращаясь в свою окисленную форму. Это происходит в реакции, катализируемой глутатион–пероксидазой (семейство селен–зависимых ферментов).

4. Для освобождения низкомолекулярных внутриклеточных компонентов разрушим клеточные мембраны и денатурируем белки клетки трихлоруксусной кислотой.

К образцам (1), (2) и (3) добавим 0.2 мл 20 % трихлоруксусной кислоты.

Для осаждения денатурированных белков и обрывков мембран подвергнем образцы центрифугированию. Надосадочная жидкость прдставляет раствор кислотно–растворимых низкомолекулярных компонентов клетки.

5. Определим в надосадочной жидкости содержание восстановленного глутатиона GSH.

Предварительно приведем значение рН среды к нейтральному. Для этого к 1 мл супернатанта (надосадочной жидкости) добавим 1 мл 0,5 Мнатрий–фосфатного буфера, рН 7,8.

Среди различных реагентов, используемых для специфического определения сульфгидрильных групп, наибольшую популярность приобрел реагент Эллмана: 5,5 – дитиобис (2–нитробензойная кислота)(Ellman, 1959), дисульфидное соединение. При рН 7.8–8.0 в реакциях с SH–группами реагент Эллмана образует окрашенный анион нитротиофенолята и смешанный дисульфид:

К 2 мл раствора добавим 30 мкл реактива Эллмана, концентрации
5∙10^–3М. Количество образующегося аниона нитротиофенолята численно равно количеству прореагировавших SH–групп, определяем количество аниона нитротиофенолята по специфическому поглощению при 412 нм, используя коэффициент молярной эксцинции ε = 13600 М^–1Тсм^–1. Описанный метод обладает высокой чувствительностью и специфичностью.

6. Определим оптическую плотность образцов (1) и (2), используя образец (3) в качестве кюветы сравнения (это так называемая проба на реактивы, содержащая все реагенты за исключением определяемого глутатиона).

7. Рассчитаем концентрацию внутриклеточного восстановленного глутатиона с учетом гематокрита суспензии и внесенных реагентов (разбавление образца):

[GSH]= Д⁴¹² / 13600 ∙10 ∙ 1,1 ∙2 ∙1,03

Опишите полученный результат и принципы метода.